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背景和研究目的糖尿病是一组以高血糖为特点的代谢性疾病。近年来,全球糖尿病患病率呈逐渐攀升趋势,2019年,中国患者数已达1.164亿,其中约90%的患者为二型糖尿病（T2DM）,成为全球糖尿病患病人数最多的国家。目前,针对T2DM的治疗药物如双胍类、格列奈类、磺脲类、α-糖苷酶抑制剂类和噻唑烷二酮类尽管有一定的治疗效果,但易造成低血糖和胃肠道不适等副作用。胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物作为一类新型的T2DM治疗药物,因疗效显著、临床应用安全性高而备受青睐,但价格昂贵且需长期注射给药也限制了其应用。研究发现,内源性GLP-1的氨基酸序列中存在可被二肽基肽酶-4（DPP-IV）识别的位点而易被其降解,因此半衰期极短,严重限制了其生理效能。当前主要采取两种策略来延长其半衰期:1)优化天然GLP-1序列,使其既能保持生物活性又能抵抗DPP-IV的降解作用;2)开发DPP-IV抑制剂,通过抑制其活性来减少GLP-1的降解从而增加GLP-1的机体循环浓度。而除了上述两种方法,是否还有其他更好的方案来延长GLP-1在体内的存在时间呢?因此,基于肠道菌群与T2DM的密切联系以及GLP-1易降解、价格贵、需注射给药的缺陷,我们拟通过益生菌（植物乳杆菌L.plantarum）为药物载体构建长效、口服型GLP-1补充剂,即构建一株植物乳杆菌工程菌L.plantarum-p MG36e-GLP-1。该方案所提出的益生菌药物疗法的新思路,还对调控T2DM患者的肠道菌群平衡有积极作用。在本研究中,我们通过建立高脂饮食（HFD）喂养联合链脲佐菌素（STZ）诱导的T2DM小鼠模型和自发性db/db小鼠模型评价其治疗效果,旨从多方面、多角度探讨工程菌对T2DM的作用机制,为新型T2DM药物的开发和临床应用提供参考依据。实验方法1.工程菌的构建及益生特性评价1.1工程菌的构建及验证:通过基因工程方法构建重组质粒p MG36e-GLP-1,然后电转入植物乳杆菌中,菌株构建成功后通过WB和ELISA检测工程菌发酵上清中GLP-1分泌表达量。1.2工程菌质粒遗传稳定性评价:连续传代30天,每隔3天平板划线后挑取100个单菌落点在红霉素抗性平板上,观察其生长情况后计算遗传稳定率。1.3工程菌的益生性质评价:对工程菌进行耐酸实验、耐胆盐实验、抗氧化性实验、抑菌实验和细胞粘附实验。2.HFD喂养联合STZ诱导的T2DM小鼠模型的建立,给药及疗效评价2.1建立HFD喂养联合STZ诱导的T2DM模型:60只8周龄（体重在20g-22 g）C57BL/6雄性小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物公司。以正常饲料适应性喂养一周后测量血糖体重,并给予高脂饲料直至实验结束。随机选取12只小鼠作为对照组,其余小鼠连续5天腹腔注射30 mg/kg STZ。空腹血糖高于11.1mmol/L时纳入研究,并将糖尿病小鼠随机分成模型组,植物乳杆菌治疗组,工程菌治疗组和阳性药物艾塞那肽治疗组。小鼠动物伦理审查批准编号:RYE2019100801。2.2给药方式:（1）对照组（C组）:灌胃100μL细菌包被液（0.9%的生理盐水中含有0.01%的明胶）,每天1次,持续治疗9周;（2）模型组（M组）:灌胃100μL细菌包被液,每天1次,持续治疗9周;（3）植物乳杆菌治疗组（Lac组）:灌胃100μL以包被液重悬的植物乳杆菌,菌液浓度为1010 CFU/m L,每天1次,持续治疗9周;（4）工程菌治疗组（Lac-G组）:灌胃100μL以包被液重悬的工程菌,菌液浓度为1010 CFU/m L,每天1次,持续治疗9周;（5）艾塞那肽组（P组）:腹腔注射阳性药物GLP-1受体激动剂艾塞那肽（24 nmol/kg/d）治疗,每天1次,持续治疗9周。2.3疗效评价:通过检测小鼠血糖、体重和葡萄糖耐受情况评价工程菌对HFD喂养联合STZ诱导的T2DM小鼠模型的治疗效果。2.4机制分析:应用WB检测炎症通路相关蛋白（TLR-4、My D88、NFκB）和增殖凋亡通路相关蛋白（Bax、Bcl-2、AKT）的表达水平;通过q-PCR检测炎症因子（IL-1β、IL-6、TNFα）的转录情况;采用HE染色、免疫荧光评价胰岛组织损伤、胰岛β细胞增殖及胰岛素的分泌情况;通过高通量测序分析工程菌对小鼠肠道菌群的影响。3.db/db小鼠模型的治疗方案及疗效评价2.1自发性db/db小鼠模型:8只野生型小鼠和32只db/db小鼠购自常州卡文思实验动物中心,8只野生型小鼠作为对照组,其余小鼠每组8只,随机分成模型组,植物乳杆菌治疗组,工程菌治疗组和阳性药物艾塞那肽治疗组。小鼠动物伦理审查批准编号:RYE2019100801。2.2给药方式:与HFD喂养联合STZ诱导的T2DM小鼠给药方式相同。2.3疗效评价:通过检测小鼠血糖、体重和葡萄糖耐受情况评价工程菌对db/db小鼠模型的治疗效果。2.4机制分析:应用WB检测炎症通路相关蛋白（TLR-4、My D88、NFκB）和增殖凋亡通路相关蛋白（Bax、Bcl-2、AKT）的表达水平;通过q-PCR检测炎症因子（IL-1β、IL-6、TNFα）的转录情况;采用HE染色、免疫荧光评价胰岛组织损伤、胰岛β细胞增殖及胰岛素的分泌情况;特别的,在db/db糖尿病模型中,应用油红O染色检测肝脏脂肪含量及脂滴大小,同时采用q-PCR检测肝脏脂肪氧化相关基因（Pparα、Cpt-1、Acox-1）和脂肪合成相关基因（Srebp-1、Fasn、Acaca）的转录情况。实验结果1.工程菌的构建及益生特性评价1.1通过WB能在工程菌培养上清液中检测到GLP-1的表达,ELISA检测到GLP-1的表达量为80 pg/m L（GLP-1在正常人体中的表达量约为1-5 pmol/L）。1.2遗传稳定性实验结果表明,重组质粒p MG36e-GLP-1在无红霉素抗性培养基中连续培养6天的质粒稳定率为100%,而即使连续培养30天,质粒稳定率仍能达到86%。1.3益生菌的体外益生特性结果显示,工程菌具有良好的耐酸、耐胆盐、抗氧化、抑菌和细胞粘附能力。2.工程菌对HFD喂养联合STZ诱导的T2DM小鼠的治疗2.1血糖表型检测结果表明,相比于M组,工程菌可降低T2DM小鼠血糖,抑制体重增长,改善糖耐。2.2对胰腺炎症检测结果表明,相比于M组,工程菌下调了胰腺组织炎症相关蛋白（TLR-4、My D88、NFκB）的表达,并在转录水平（q-PCR）抑制了促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNFα）的表达。2.3对胰岛细胞凋亡增殖检测结果显示,相比于M组,工程菌下调了凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2的比值,同时增加抗凋亡相关蛋白p-AKT/AKT的比值;此外,HE和免疫荧光染色表明,相比于M组,工程菌促进了胰岛组织形态修复和胰岛β细胞增殖,提高了胰岛素的分泌。2.4对肠道菌群的分析结果表明,相比于M组,工程菌提高了T2DM小鼠的肠道菌群丰富度和多样性,并增加了益生菌Akkermansia和Lactobacillus的丰度,减少了致病菌Bacteroides的丰度。3.工程菌对db/db小鼠的治疗3.1血糖表型检测结果表明,相比于M组,工程菌治疗改善了db/db小鼠的血糖和糖耐,并抑制了体重增长。3.2对胰腺炎症检测结果表明,相比于M组,工程菌降低了炎症相关蛋白TLR-4、My D88和p-NFκB/NFκB的表达,同时在转录水平（q-PCR）抑制了促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNFα）的表达。3.3对胰岛细胞凋亡增殖检测结果显示,相比于M组,工程菌下调了凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2的比值,同时增加抗凋亡相关蛋白p-AKT/AKT的比值;HE和免疫荧光染色也表明了工程菌对胰岛组织形态修复、胰岛β细胞增殖和胰岛素的分泌有促进作用。3.4对肝脏脂肪脂质代谢检测结果表明,相比于M组,工程菌上调了脂肪氧化相关基因（Pparα、Cpt-1、Acox-1）的表达,同时抑制了脂肪合成相关基因（Srebp-1、Fasn、Acaca）的表达。结论综上所述,本研究构建了一株口服、长效发挥作用的GLP-1工程菌,即L.plantarum-p MG36e-GLP-1。体外实验表明工程菌可成功表达GLP-1,同时具有良好的遗传稳定性和益生菌益生特性。在动物实验中,我们发现工程菌可通过抑制胰腺炎症和胰岛细胞凋亡,增加肠道益生菌,减少致病菌,同时上调脂肪β氧化相关基因的表达,抑制脂肪合成相关基因的表达从而逆转两种T2DM模型小鼠（HFD喂养联合STZ诱导和自发性db/db小鼠）的血糖,改善糖耐量,并抑制小鼠体重增长。本研究在两种T2DM动物模型上,通过多种技术手段进行多方面机制分析,为新型T2DM药物的开发和临床应用提供了参考依据。