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皮肤缺损创面修复是整形外科临床常见问题之一。目前广泛采用自/异体皮肤移植修复皮肤创面缺损,但是这种方法存在着皮肤来源受限、对机体产生二次创伤等缺陷。组织工程皮肤的研发和应用为皮肤缺损修复提供了新的治疗策略。目前已有组织工程化的真皮和全层皮肤等产品上市,然而这些“人工皮肤”目前仅发挥遮盖创面和加速愈合的功能,尚不是真正意义上的具有色泽、排汗、生发等生物学功能的正常“皮肤”组织,因而构建具有正常生物学功能的组织工程皮肤是该领域今后需重点关注的研究课题。皮肤中的黑色素细胞对于皮肤色泽的调节以及防止紫外线照射引起的细胞损伤起着重要的作用。本研究在前期以骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）为种子细胞构建组织工程全层皮肤的研究基础上,将黑色素细胞与BMSCs以适合的比例混合培养,并利用Ⅰ型胶原膜为支架材料构建含有色素细胞的组织工程皮肤,为研发具有色素功能的组织工程皮肤提供理论依据。研究目的1、建立获得大量高纯度的黑色素细胞和BMSCs的培养方法,并对两种细胞进行生物学性状鉴定。2、探索黑色素细胞和BMSCs混和培养的方案,并以二者为种子细胞复合Ⅰ型胶原膜体外构建含黑色素细胞的组织工程皮肤。3、评价含黑色素细胞的组织工程皮肤体内移植效果。研究方法1、以包皮组织作为细胞来源,用消化法获得表皮细胞悬液,通过黑色素细胞完全培养基进行培养筛选,并通过低浓度胰酶消化法进行传代培养,然后对其进行DOPA染色、免疫组化检测（S-100蛋白）和透射电镜观察,以及生长曲线的检测;同时进行BMSCs的分离培养,对其表面抗原及其多向分化潜能进行鉴定。2、构建Ⅰ型胶原膜,筛选适合混合培养黑色素细胞和BMSCs的培养基,确定该两种细胞与Ⅰ型胶原膜复合构建含有黑色素细胞的组织工程皮肤的方案,并通过免疫组化检测（S-100蛋白）和扫描电镜检测构建的组织工程皮肤生物学性状。3、建立裸鼠背部皮肤缺损动物模型,将体外构建的含有色素细胞的组织工程皮肤移植到裸鼠背部缺损创面,在术后不同时间点获取标本,通过大体标本观察、DAPI体内示踪标记、HE染色、免疫组化检测（S-100蛋白）及透射电镜检测等方法观察组织工程皮肤修复皮肤创面缺损及生成色素情况。研究结果1、原代培养的黑色素细胞呈多树突状,传至第二代后开始呈现两极细尖的长梭形,S-100蛋白免疫组化染色及DOPA染色为阳性,透射电镜观察胞浆内含有大量的黑色素小体;通过骨髓获得的BMSCs原代培养时最初呈成纤维细胞样集落生长,传代后形态均一,呈宽大的长梭形,扩增后的BMSCs不表达CD34和CD11a;CD29强表达;CD71仅有微弱表达,对数生长期的细胞中80%以上处于G0/G1期,G2/M期占11%,S期的细胞占7%左右,染色体核型分析为女性正常核型。BMSCs在向脂肪细胞诱导后第5～6天胞浆内就有小的脂滴出现,诱导第2周时细胞分化达高峰,细胞体积达到最大,胞质内脂滴数量最多。第3周时进行油红0染色,可见细胞内脂滴被红染。BMSCs在向成骨细胞诱导条件下培养第7天后细胞形态开始发生明显变化,经14天诱导后形态类似成骨细胞,对诱导3周的成骨样细胞进行碱性磷酸酶染色,可见细胞胞体周围有深浅不一的浅黑色受染区。BMSCs的S-100蛋白免疫组化染色为阴性。2、未交联的Ⅰ型胶原膜呈白色海绵状,抗撕拉能力差,交联后的胶原膜为半透明的无色薄膜,柔韧适度,富有弹性,具有一定的抗撕拉能力。在24孔板单孔大小的胶原膜上于第1天种植2×106个BMSCs,以BMSCs完全培养基培养,然后第2天种植2×105个黑色素细胞,以黑色素细胞完全培养基培养可以构建出含有混和细胞的组织工程皮肤;扫描电镜观察发现黑色素细胞及BMSCs在胶原膜上可以良好生长;S-100蛋白的免疫组化可以观察到种植在组织工程皮肤上的黑色素细胞呈阳性反应。3、术后第2周各组皮肤创面开始愈合。大体标本观察两组含有BMSCs的组织工程皮肤的愈合情况要好于含有单纯黑色素细胞组织工程皮肤组,创面小,血痂少;HE染色可以看到前两组的表皮结构厚,细胞排列更为有序;S-100蛋白免疫组化染色可以看到含有黑色素细胞的两组组织工程皮肤为阳性反应,而含有单纯BMSCs的组织工程皮肤组为阴性反应。透射电镜观察可以看到在成活的组织工程皮肤中含有黑色素细胞,并且与基底膜之间形成半桥粒连接;表皮细胞排列整齐,胞质含有大量张力细丝;相邻的表皮细胞之间形成桥粒连接。在术后第1、2周时可以看到DAPI标记的人黑色素细胞。研究结论1、通过低浓度胰酶消化培养法可以从人包皮组织中获得大量高纯度生长状态良好的黑色素细胞;从骨髓中分离得到的BMSCs遗传性状稳定,具有多向分化潜能,二者可以作为构建组织工程皮肤的种子细胞来源;S-100蛋白免疫组化反应可以用来鉴别黑色素细胞和BMSCs混和生长的细胞群中的黑色素细胞。2、BMSCs完全培养基和黑色素细胞完全培养基在细胞培养的前3天内可以彼此互相替代;以105个/cm2级别的黑色素细胞和106个/cm2级别的BMSCs比例混合与Ⅰ型胶原膜复合可以在体外构建含有黑色素细胞的组织工程皮肤。3、本研究中构建的组织工程皮肤含有生成黑色素的功能结构,可以有效地修复实验动物皮肤缺损创面。