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研究背景和目的原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是世界范围内发病率最高的恶性肿瘤之一,是临床上肝脏最常见的原发性恶性肿瘤,其起病隐匿、进展迅速,难以早期诊疗、预后很差,严重威胁着人类的健康。HCC的发生是一个多因素参与多步骤相互协同的复杂过程,其中乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)的感染在所有诱发HCC的因素中最为常见和重要,HBV可通过多种途径引起HCC的发生,其表达产物之一乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus x protein, HBx)为一种多功能蛋白,可通过活化相关反式作用因子,与机体多种蛋白发生交互作用以及刺激细胞内多种信号转导通路等,在诱发肝细胞癌变的整个进程中发挥着重要的作用。为了提高HCC患者生存质量,合理用药及个体化治疗是其中关键的措施,而选择合适的治疗药物与肝脏内药物代谢酶的表达和功能紧密相关。细胞色素P450酶(cytochrome P450s, CYP450s)是肝脏内重要的药物代谢酶,所催化的Ⅰ相代谢反应是药物在机体内代谢最关键的一步；CYP3A4是CYP450s中最重要的药物代谢酶亚型之一,在肝脏分布最为丰富,其与肝脏疾病的相互影响也更为密切。调控CYP3A4进而影响其表达水平和功能的因素众多,孕烷X受体(Pregnane X receptor, PXR)及同型受体视黄醇X受体(Retinoid X Receptor a, RXRa)二聚体通路是其中最为经典的机制,因此从最经典的PXR/RXRa二聚体通路出发,研究HBV相关的HCC中CYP3A4表达水平的变化及其调控的干预机制具有非常重要的意义。前期研究结果显示,HBV相关的HCC中,肿瘤组织与癌旁正常组织相比,HBx在细胞核内蛋白水平呈现高表达的同时,CYP3A4的基因及蛋白表达水平明显下调,而PXR和RXRα核内蛋白表达水平则未呈现平行性下调趋势,提示PXR/RXRa二聚体并非通过改变自身表达而发挥对CYP3A4的调控作用,可能是通过改变与CYP3A4顺式作用元件的结合能力而影响了CYP3A4的表达,同时HBx的高表达提示HBx可能干预了CYP3A4的表达调控机制。基于前期研究结果的分析,为了进一步验证HBx干预了PXR/RXRa二聚体与CYP3A4顶式作用元件的结合进而影响了CYP3A4的表达,以及探讨HBV全基因组内HBx在影响CYP3A4表达调控中的作用,首先本实验将收集20例HBV相关的HCC的肿瘤组织和癌旁正常组织标本,检测CYP3A4基因近端启动子、远端增强子、最远端增强子序列的单核苷酸多态性,排除单核苷酸多态性对PXR/RXRa二聚体调控通路的影响；并从中选择10例标本,采用凝胶迁移实验方法,考察HBV相关的HCC的肿瘤组织与癌旁正常组织中PXR/RXRa与CYP3A4顺式作用元件之一最远端增强子的反转重复序列(Far-everted repeat separated by6base pairs, Far-ER6)的结合能力,从而评价肿瘤组织中该结合能力的改变,并探讨HBx与其关系；为了进一步阐明HBx可作为独立因素干预CYP3A4的表达调控,本研究将构建肝癌细胞瞬时转染模型(HepG2-P, HepG2-P/H, HepG2.2.15-P,其对照模型分别为HepG2-M和HepG2.2.15-M),考察上述细胞模型中CYP3A4的基因及蛋白表达水平的差异,以及PXR/RXRa与CYP3A4基因Far-ER6区域结合能力的差异,进一步探讨HBx在调控CYP3A4的PXR/RXRa二聚体通路中的干预作用。研究方法1.单核苷酸多态性研究：采集20例HBV相关的HCC患者的肿瘤组织和癌旁组织标本,提取基因组DNA,针对编码区上游近端启动子、远端增强子、最远端增强子序列设计引物进行相应序列的扩增,扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化后,回收目的片段进行测序实验,测序结果采用Chromas软件观察、比对,于UCSC网站和Genomatix网站进行序列分析。2.肝癌细胞瞬时转染模型构建：以肝癌细胞株HepG2、HepG2.2.15为研究对象,以pcDNATM3.1(+/-)质粒为真核表达载体(Mock), hPXR基因以人缘化细胞cDNA为模板,hHBx基因以合成的寡核苷酸序列为模板,根据hPXR, hHBx基因编码区序列设计引物,扩增相应序列并纯化,酶切扩增产物和载体后,进行目的片段和载体的连接构建hPXR和hHBx质粒DNA,采用细胞瞬时转染技术,以共转染含目标基因质粒的方式进行肝癌细胞瞬时转染模型构建。3.蛋白质印迹法(Western blot)考察蛋白表达水平：提取肝癌细胞瞬时转染48小时后的细胞核蛋白、总蛋白,经浓度测定后,根据上样量稀释蛋白原液,蛋白经变性后,上样于变性凝胶中,分别选取组蛋白Histone H3和肌动蛋白β-actin作为内参。电泳将各目标蛋白分离,通过湿转法将蛋白转至PVDF膜上,经封闭液封闭后,孵育相应的特异性一抗和二抗,经免疫发光法显现目标条带。采用Quantity One软件对条带光密度值进行检测,以此对蛋白表达水平进行相对定量分析。4.聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)考察基因表达水平：提取肝癌细胞转染48小时后的mRNA,并逆转录为cDNA,以其为模板,依据目标基因序列以及引物设计的原则,采用Primer Premier6.0软件设计目标基因的引物,以人类的GAPDH作为内参基因,进行PCR反应,采集正确扩增条件下的Ct值,根据RQ计算方法,对基因表达水平进行定量分析。5.凝胶迁移实验(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)考察核蛋白PXR/RXRα与CYP3A4基因Far-ER6区域的结合能力：提取HBV相关的HCC的肿瘤组织及其癌旁正常组织以及瞬时转染48小时后的肝癌细胞的核蛋白,经生物素树脂纯化后,以其作为DNA结合蛋白,以生物素标记的CYP3A4基因的Far-ER6序列作为核受体识别的探针,以未标记的Far-ER6序列作为冷竞争,以RXRα抗体和HBx抗体作为超迁反应体系的抗体,根据核蛋白与探针的结合条带的深度和迁移距离评价PXR/RXRa与CYP3A4基因的Far-ER6区域的结合能力,并进行比较分析。6.统计学分析方法：采用SPSS13.0统计软件进行数据分析。以率表示的计数资料选用卡方检验进行比较,正态分布的两计量资料间比较采用两独立样本t检验进行分析,正态分布的多计量资料间比较采用方差分析F检验,P值取双侧,当P<0.05认为差异具有统计学意义。结果1. CYP3A4基因远端增强子的-7786位点与原序列相比对出现了新的突变,由C突变为A,最远端增强子的-10570位点与原序列相比对,由T突变为C；两个突变位点所对应的基因频率和基因型频率在肿瘤组织和癌旁正常组织中均无统计学差异(P>0.05),两突变位点均未出现在CYP3A4顺式作用元件的核受体结合域及其附近序列中。2.10例HBV相关的HCC肿瘤组织中,PXR/RXRa二聚体与Far-ER6序列结合条带的平均迁移距离较癌旁正常组织下降36.9%(P<0.001),迁移条带的平均深度在二组间的差异无统计学意义(P>0.05)。超迁体系中的迁移条带呈现上移或减淡趋势。3.肝癌细胞瞬时转染模型中,RXRa的基础核内蛋白表达水平在各转染肝癌细胞模型间无差异(P>0.05)；相比于转染对照组(M),转染了含目标基因质粒的两种肝癌细胞中,其目标基因对应的核内蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),同种目标基因的核内蛋白表达水平在含有该转染基因的不同细胞间无显著差异(P>0.05)。4. CYP3A4在肝癌细胞瞬时转染模型中的基因表达水平显示,相比于转染对照组(M),转染了hPXR的肝癌细胞HepG2和HepG2.2.15细胞模型中的CYP3A4基因表达水平均显著升高,分别升高了11.3倍和5.8倍(P<0.001),而同时转染了hHBx的HepG2细胞中CYP3A4的基因表达水平较未转染的HepG2细胞显著降低,仅为后者的8.1%(P<0.001)；相比于共转染hPXR/Mock的HepG2细胞,共转染hPXR/Mock的HepG2.2.15细胞中的CYP3A4基因表达水平较低,仅为前者的53.4%(P<0.001);相比于共转染hPXR/Mock的HepG2.2.15细胞,共转染了hPXR/hHBx的HepG2细胞的CYP3A4基因表达水平较低,仅为前者的15.2%(P<0.001)。5.在瞬时转染的肝癌细胞模型中,CYP3A4蛋白表达水平提示,相比于转染对照组(M),转染了hPXR的肝癌细胞HepG2和HepG2.2.15中的CYP3A4蛋白表达水平均显著升高(P<0.001),而同时转染了hHBx的HepG2细胞中CYP3A4的蛋白表达水平较未转染的HepG2细胞显著降低,仅为后者的29.7%(P<0.001)；相比于共转染hPXR/Mock的HepG2细胞,共转染hPXR/Mock的HepG2.2.15细胞中的CYP3A4蛋白表达水平较低,仅为前者的52.6%(P<0.001)；相比于共转染hPXR/Mock的HepG2.2.15细胞,共转染]hPXR/hHBx的HepG2细胞的CYP3A4蛋白表达水平较低,仅为前者的56.5%(P<0.001)。6.肝癌细胞瞬时转染模型中核蛋白与Far-ER6序列的结合能力比较,转染了hHBx的HepG2细胞核蛋白与Far-ER6序列的结合条带的深度显著降低,较未转染者下降了92.5%；相比于共转染hPXR/Mock的HepG2细胞,共转染hPXR/Mock的HepG2.2.15细胞核蛋白与Far-ER6序列结合条带的深度明显低于前者,仅为前者的37.3%(P<0.001)；相比于共转染hPXR/Mock的HepG2.2.15细胞,共转染hPXR/hHBx的HepG2细胞核蛋白与Far-ER6序列结合条带的深度显著低于前者,仅为前者的20.1%(P<0.001)；加入RXRa和HBx抗体后,迁移条带均呈上移趋势。结论1.20例由HBV相关的HCC的肿瘤组织和癌旁正常组织中,CYP3A4的远端增强子的-7786位点和最远端增强子的-10570位点出现了新的SNPs,但这些新的SNPs在HCC的肿瘤组织和癌旁正常组织间的分布无统计学差异,并且这些新的SNPs与CYP3A4的表达调控无明显相关性。2.HBV相关的HCC组织中,肿瘤组织内PXR/RXRa二聚体与CYP3A4基因Far-ER6序列的结合能力显著低于癌旁正常组织,这与HBx在前者核内的高表达成相反趋势。3.HBx在肝癌细胞核内的高表达可抑制CYP3A4的基因表达和转录活性,相比于HBV全基因组,HBx的单独高表达对CYP3A4的基因表达和转录活性的抑制作用更为显著。4.瞬时转染后的肝癌细胞中,HBx在细胞核内的高表达可降低PXR/RXRα二聚体与CYP3A4基因Far-ER6序列的结合能力,且相比于HBV全基因组,HBx的单独高表达可更为显著地降低二者间的结合能力,HBx是HBV全基因组中发挥对CYP3A4表达调控抑制作用的关键功能蛋白。5.HBV相关的HCC组织和瞬时转染的肝癌细胞模型实验均表明HBx参与到了PXR/RXRa二聚体和CYP3A4基因Far-ER6区域相互作用的过程中。综上所述,HBx干预了PXR/RXRa二聚体与CYP3A4基因Far-ER6区域的结合,通过抑制CYP3A4增强子的作用,减弱CYP3A4的转录活性从而降低HBV相关的肝细胞癌中CYP3A4的基因及蛋白表达水平。HBx的干预引起的CYP3A4在HCC中表达水平及其功能的改变,可为HCC患者的合理用药及个体化治疗提供理论依据。