背景和目的Hippo信号通路中的抑癌基因Mst1/2-Sav1和Lats1/2-Mob的激活会导致YAP/TAZ的磷酸化,并促使其在胞浆中降解。YAP/TAZ也受细胞与细胞接触的影响,这种影响主要是靠通过紧密连接和粘附来发挥作用的。抑制Hippo信号通路会导致YAP/TAZ舌化,并导致其核转移。一旦与细胞结合位点TEAD1-4, p53等结合就会启动他们的高表达。先前研究显示Hippo信号通路,通过调节细胞增殖和凋亡来调控组织器官的大小。Yap激活后可逆性增加肝脏大小超过4倍,但是持续性过表达则会引起肝癌,Yap在心肌细胞中的过表达会导致心肌细胞增生使的相邻腔隙闭塞从而导致心肌增生。Yap在小鼠胚胎干细胞分化过程中是被抑制甚至是失活的,但是在诱导多能干细胞(iPS)的过程中是被激活而且高表达。在小鼠胚胎干细胞的发育过程中将Yap敲除会导致它多能型的丧失,相反如果Yap过表达则会导致胚胎干细胞分化功能的受阻。此外,Yap也调节组织特异性祖细胞的发育,小肠上皮中Yap的表达一般被限制在正常小鼠小肠上皮祖细胞,Yap的基因的过表达,在小鼠肠道导致的细胞祖细胞高度聚集且分化能力降低；而Yap在小鼠皮肤中的过表达会导致在小鼠皮肤表皮基底细胞巢扩大,并抑制其终末分化。在哺乳动物中,Yap也显示出它在组织再生中发挥着重要的作用。在野生型小鼠Yap仅能在小肠隐窝上皮细胞中检测到,但是在葡聚糖硫酸钠诱导肠道损伤明显诱导Yap的表达,如果Yap缺失,肠道损伤再生受到阻碍。同时在Yap基因敲除小鼠肝发育中不仅导致肝细胞的凋亡也导致了在胆管的发育中出现障碍。小鼠切牙是不断生长的,这种现象持续存在于它的整个生命周期,这种现象的发生是受存在于小鼠唇侧上皮干细胞支持的。牙源性上皮干细胞产生内釉上皮,星状网,中间层和外釉质上皮层,并且能够分化成釉细胞。唇侧颈环上皮干细胞的增殖和迁移,分化为成釉细胞并沿唇面逐步矿化成为牙釉质。相比之下,舌侧颈环包含较少增殖的干细胞,在切牙齿的舌面则缺乏牙釉质的形成。Pitx2基因被证明在小鼠早期牙胚的发育中起到很重要的作用,Pitx2基因编码三种异构体,小鼠Pitx2a, Pitx2b和Pitx2c和第四种Pitx2亚型Pitx2d,这种亚型仅存在于人类中Pitx2a, Pitx2b和Pitx2c亚型在牙源性上皮中表达,而且持续表达与在牙齿上皮结构。因此可以利用Pitx2作为驱动子来产生特定细胞种类或特定区域内的基因敲除,或者是基因的过表达。本研究主要通过采用荧光示踪来展示Pitx2-Cre基因在小鼠切牙及磨牙发育过程中的蕾状期,帽状期,钟状期,分泌期的表达,同时检测Yap基因在小鼠牙齿发育过程中时空特异性表达模式,并且在牙源性上皮特定敲除和敲入Yqp基因,观察其对小鼠牙齿发育的影响。方法Pitx2-Cre;TomatoAi14;C57不同时期胚胎的获取后,冰冻切片后用荧光示踪方法检测Pitx2-Cre基因在小鼠牙齿发育不同阶段表达,同时用原位杂交技术检测Yap基因在小鼠牙齿发育过程中时空特异性表达。利用Pitx2-Cre在牙源性上皮中表达模式,构建Yap的条件敲除小鼠,以及转基因小鼠,检测Yap基因在牙源性上皮细胞及牙齿发育中的作用。结果Part11. Pitx2-Cre基因可从帽状期,钟状期,分泌期均可见到Pitx2-Cre基因在磨牙与切牙的内釉上皮,外釉上皮,以及cervical loop区域高表达。2.在蕾状期,帽状期,钟状期,分泌期的磨牙及切牙中均可见到Yap的表达,其主要分布区域在上皮细胞层,Yap基因可在颊侧与舌侧的颈环区域表达,在间充质细胞表达较弱。Part21.Pitx2-Cre;Yap flox/flox与正常小鼠比较其体型没有改变,颜面部发育正常,未见牙列缺损,但是牙齿的色泽茭白,而且牙齿形态较小,左右不对称,表面光滑度较差。磨牙区牙釉质呈现低密度影像,咬合面牙釉质缺损严重,牙冠近远中面可见牙釉质发育不全不能完整覆盖近远中侧,但牙冠的颊舌面发育正常,牙齿的外形高点线位置发生改变,牙根较正常组粗大,牙周膜不明显；切牙舌侧出现高密度影像,即异位表达的牙釉质,同时颊侧的牙釉质覆盖范围减少,仅在靠近中线处有少量牙釉质覆盖。2.扫描电镜显示切牙形态小,切牙切端呈现切割状,牙釉质基本结构釉柱较少,即使存在少量的釉柱也被包裹在无定型的基质中间。磨牙显示萌出时间晚于正常,而且牙尖发育异常,在牙尖周围可见大量散落的小的釉珠。3.HE染色显示,在E14.5天下颌第一磨牙区未见明显异常,E16.5/E18.5磨牙形态减小,牙乳头及牙囊未见明显发育异常,内釉上皮层,外釉上皮层断裂,在星网状层显示有较大血管的形成,并且显示向牙乳头层方向侵入生长；E16.5/E18.5天切牙cervical loop减小,牙乳头及牙囊未见明显发育异常。4.1n situ显示Pitx2-Cre; Yapflox/flox基因敲除小鼠E18.5cervical loop区域出现Fgf3与Fgd9的表达；Msxl的表达降低；Amelogenin表达在切牙舌侧出现表达证明舌侧异位牙釉质的出现；Dspp的表达在E18.5的切牙舌侧的成牙釉质细胞与成牙本质细胞,而正常小鼠仅在切牙舌侧成牙本质细胞表达；p21的表达在未见明显异常表现；MMP20/Follistatin的表达也出现在舌侧成牙釉质细胞层,Follistatin在唇侧成釉细胞表达增强。Part31.Pitx2-Cre; YAP Tg转基因小鼠体型变小,可见牙列缺损。磨牙区牙釉质呈现低密度影像,牙根较正常组短,牙周膜不明显,牙冠近远中面及颊舌面未见牙釉质覆盖,但是在牙冠内区域出现环状影像；切牙牙釉质覆盖范围减少,仅在靠近中线处有少量牙釉质覆盖未见异位表达牙釉质。2.HE染色显示,在E14.5/E16.5/E18.5磨牙牙乳头及牙囊未见明显发育异常,成釉器外釉上皮层,星网状层发育未见明显异常,E16.5内釉上皮层轻微增生；E18.5内釉上皮层向星网状层方向增生,cervical loop区域膨大。在E16.5/E18.5牙乳头及牙囊未见明显发育异常,E16.5切牙cervical loop增加,在E18.5天切牙cervical loop膨大明显,在外釉上皮层出现增生。3.Brdu染色显示,在E16.5/E18.5天下颌第一磨牙牙乳头及牙囊未见明显异常,成釉器外釉上皮层/cervical loop内釉上皮区域增值未见明显异常；在E16.5/E18.5天下颌切牙牙乳头及牙囊,成釉器内釉上皮层未见明显异常,E18.5cervical loop区域外釉上皮区域增值显著增多,而E16.5不明显。4.Fgf3在E14.5未见明显改变E16.5下颌第一磨牙的表达稍微降低,在E18.5cervical loop区域不表达,在靠近cervical loop区域的牙乳头区域表达降低；Fgf9的表达增强并且在舌侧cervical loop表达；Msxl的表达在E16.5,E18.5下颌第一磨牙及切牙cervical loop表达强度差异改变不大,但是表达区域也发生改变,在上皮层可见到表达；Amelogenin表达强度差异不明显;Dspp的表达在E18.5的切牙区前段表达增加；p21的表达在E18.5的切牙区顶端表达增强。结论1.Yap在正常小鼠牙齿的发育中是持续表达的,Yap的表达位置与强度具有时空特异性；Pitx2-Cre能够驱动特定基因在牙源性上皮细胞中表达。2.Pitx2-Cre介导的牙源性上皮细胞特定敲除Yap后,在牙齿发育钟状期开始出现内釉上皮层的断裂,在成体小鼠会显著促进切牙舌侧成釉细胞的分化,出现异位牙釉质；抑制唇侧颈环干细胞增殖,导致唇侧牙釉质发育障碍；切牙颊侧颈环减小；磨牙体积减小,近远中侧牙釉质发育障碍；牙齿萌出时间延缓。3.Pitx2-Cre介导的牙源性上皮细胞过表达Yap后,在牙齿发育钟状期开始出现内釉上皮层增殖增多,颈环膨大,在成体小鼠会显著抑制成釉细胞的分化,导致切牙及磨牙牙釉质大面积缺失,牙齿的形态减小,伴随牙列缺损；切牙颊侧颈环增生膨大。