葡萄转录因子SBP家族基因克隆、表达及功能分析

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SBP基因家族是植物中特有的。它编码一类含锌指结构的具有许多功能的转录因子。尽管SBP基因已在许多植物(包括绿藻、苔藓、银桦、金鱼草、拟南芥、水稻及玉米)中得到了鉴定及研究,但关于葡萄SBP家族基因的研究还是空白。在课题组前期对中国华东葡萄(Vitis pseudoreticulata)SBP5初步研究的基础上,利用已公布的葡萄基因组数据,系统鉴定了葡萄基因组中的所有SBP基因,并进一步对他们进行分类,内含子-外显子结构分析,进化树和同线性分析及其在不同胁迫和激素处理下的表达模式分析,同时也分析了他们在葡萄各个组织器官和果实成熟的不同阶段的表达,在此基础上进而对VpSBP5,VpSBP11和VpSBP16基因功能进行了研究。所获得的主要研究结果如下:1.在葡萄中鉴定到了18个SBP基因家族成员,其中12个含有与miRNA156/157互补的序列。系统发育树研究表明植物中的SBP基因可以分为7个亚族,其中葡萄SBP基因与双子叶被子植物的亲缘关系较近,而与单子叶被子植物的亲缘关系较远。葡萄和拟南芥之间的同线分析表明,在拟南芥相应的同线区域中存在许多葡萄SBP基因的同源基因。对SBP基因在葡萄不同组织及果实发育不同阶段的时空表达模式分析表明,没有miR156/157靶位点的葡萄SBP基因表现为组成型表达。而具有miR156/157靶位点的葡萄SBP基因因为microRNA的抑制作用表现出不同的表达模式。基因表达芯片数据以及盐胁迫和外源激素处理后的实时定量RT-PCR分析表明部分葡萄SBP基因可能参与了对生物与非生物胁迫的防御。2.采用反转录PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR),从华东葡萄‘白河-35-1’叶片中克隆得到5个SBP基因(VpSBP3、VpSBP5、VpSBP11、VpSBP12、VpSBP16),VpSBP3基因完整开放阅读框序列全长1170bp,编码390个氨基酸;VpSBP5基因完整开放阅读框序列全长3090bp,编码1030个氨基酸;VpSBP11基因完整开放阅读框序列全长510bp,编码170个氨基酸;VpSBP12基因完整开放阅读框序列全长1137bp,编码379个氨基酸;VpSBP16基因完整开放阅读框序列全长1674bp,编码558个氨基酸。分析表明它们均包括一个高度保守的SBP结构域,该结构域包含两个C2HCH型的锌指结构和一个双向核定位信号。经过亚细胞定位和转录活性分析表明,他们都可以定位到核里且都具有转录激活活性。3.构建了pCAMBIA2300-35S-VpSBP16过量表达载体,并通过花絮浸染法将其导入模式植物拟南芥。结果表明在拟南芥中过量表达VpSBP16明显提高了拟南芥对于渗透胁迫,失水处理,长期干旱以及盐胁迫的耐受力。此外,在胁迫条件下,转基因株系中的活性氧(ROS)的积累也是明显少于野生对照。在含有氯化钠(NaCl)和甘露醇(Mannitol)的培养基上,VpSBP16转基因株系的萌发率显著高于野生对照。在盐胁迫培养基上,转基因株系的根长也明显长于对照。以上结果都表明VpSBP16基因在拟南芥中的过量表达提高了植株的抗盐胁迫和干旱胁迫的能力。4.接种白粉病后,VpSBP5基因的表达在抗白粉病华东葡萄‘白河-35-1’比感病的‘湖南-1’中有更快的反应。在‘白河-35-1’中,VpSBP5基因的表达被快速诱导且在处理后24-48h达到诱导最大值。而在感病的‘湖南-1’中,VpSBP5基因的诱导表达量最大值出现的时间点被推迟到处理后72-96h。此外,在‘白河-35-1’中,该基因表达主要被水杨酸(SA)和茉莉酸(MeJA)甲酯诱导。表明VpSBP5可能通过SA,MeJA信号分子途径来调控葡萄对白粉病的抗性,且葡萄株系的抗病程度可能与抗病基因出现峰值的时间点有关。5.构建了pCAMBIA2300-35S-VpSBP11过量表达载体,并通过花絮浸染法将其导入模式植物拟南芥。结果表明在长日照,短日照和正常光照培养条件下,转基因植株的开花时间都明显早于野生对照,同时在拟南芥中过量表达VpSBP11,会使拟南芥莲座叶数目减少,叶片卷曲,叶柄伸长。
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