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研究目的明确慢性肾脏病(CKD)时ROCK1的激活是否刺激线粒体裂变增加,并参与慢性肾脏病肌肉萎缩的发生和发展;研究方法体内动物实验:雄性,C57BL/6J小鼠,40只,按照实验处理方法的不同分成4组:假手术组(WT组),CKD组,假手术+Fasudil组(WF组),CKD+Fasudil组(CF组);其中,WT组行肾脏包膜剥离术,CKD组行5/6肾脏切除术,1月后,两组老鼠行尾静脉取血,测血清尿素氮(BUN)及血清肌酐(Cr)水平,筛选CKD成模老鼠;将WT组和CKD组老鼠,随机分成上述四组,配对饲养;其中WT组和CKD组老鼠,行腹腔注射生理盐水(3次/周,持续8周),高蛋白饲料喂养;WF和CF组老鼠,腹腔注射Fasudil(30mg/kg/次,3次/周,持续8周),高蛋白饲料喂养。每周测量老鼠体重。实验结束后,按照实验目的和操作步骤,收取老鼠腓肠肌、胫骨前肌等下肢肌,用于免疫荧光染色及蛋白免疫应迹(Western Blot)或Real time-PCR,检测ROCK1、MuRF1等目标分子的表达情况,从而明确Fasudil能否逆转CKD所致肌肉萎缩及线粒体裂变相关蛋白的增加。体外细胞实验:体外培养C2C12成肌细胞,2%马血清诱导细胞分化成熟,腺病毒载体ROCK1刺激细胞过表达ROCK1,对照组给予腺病毒载体GFP(绿色荧光蛋白),,按照给予刺激的不同,实验分成四组:1)Ad-GFP组,给予腺病毒载体-GFP(AAV-GFP,5nmol/l);2)Ad-ROCK1组,给予腺病毒载体-ROCK1(AAV-ROCK1,5nmol/l);3)Ad-GFPF组,在给予GFP的前提条件下,给予Fasudil(10umol/l)刺激;4)Ad-ROCK1F组,在给予AAV-ROCK1前提下,给予Fasudil(10umol/l)刺激。各组病毒刺激持续48小时。通过细胞能量代谢分析仪(Seahorse)评估C2C12成肌细胞在不同刺激条件下时,细胞呼吸过程中耗氧量及产酸率的改变情况;通过染色,证实ROCK1过表达对C2C12成肌细胞线粒体形态和功能的影响;检测各组肌萎缩相关蛋白及线粒体裂变相关基因的表达的变化情况。研究结果体内实验中,与WT组相比,CKD组老鼠,ROCK1表达增加,肌肉横截面积减少肌纤维分布左移,同时电镜下观察发现,CKD组老鼠线粒体裂变增加;CF组与CKD组相比,给予Fasudil腹腔注射老鼠,CKD所致肌肉横截面积减少不明显,肌纤维分布右移,肌萎缩相关蛋白MuRF及线粒体裂变相关蛋白p-Drp1表达减少。体外实验中,Seahorse检测线粒体应激变化时,Ad-ROCK组较GFP组细胞基础呼吸、最大呼吸、额外呼吸增加,给予FCCP刺激后,细胞呼吸的耗氧量及产酸率也明显增加;细胞线粒体染色观察到,Ad-ROCK组细胞线粒体裂变增加,表现为碎片化,线粒体裂变蛋白p-Drp1表达增加,而且活性氧的的释放增加;给予Fasudil刺激后,能明显改善ROCK1过表达所导致的p-Drp1,MuRF1、Atrogin1的增加,纠正细胞呼吸异常。研究结论慢性肾脏病时,激活ROCK1,刺激线粒体裂变增加,增加活性氧释放,并增加细胞耗氧量和产酸率,影响蛋白的合成和降解速率,参与肌肉萎缩的发生;Fasudil作为ROCK1的抑制剂,能够在一定程度上阻断ROCK1通过激活p-Drp1所引起的线粒体裂变增加,从而阻断由此继发的一系列不良影响,并最终实现改善肌肉肌肉萎缩的目的,为临床防治慢性肾脏病肌肉萎缩提供新的思路及方法。