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目的: Müller细胞是包括人在内的脊椎动物视网膜中胶质细胞的主要类型,它不仅能支持神经元活动、调节神经递质循环、维持细胞外环境稳定,而且可以调节视网膜血管通透性。视网膜Müller细胞发育及功能障碍将导致视功能丧失、神经元死亡、视网膜细胞水肿等。因此,Müller细胞对视网膜发挥其正常的生理功能来说是必须的。本课题组前期研究发现视网膜特异性敲除Znhit1能够影响小鼠的视功能,并导致视网膜血管变细以及周围血管簇消失。与对照组小鼠相比,5周龄实验组小鼠视网膜Müller细胞结构紊乱,数量减少。为了进一步探究视网膜特异性敲除Znhit1对Müller细胞的影响,并研究其可能的机制,本实验利用视网膜特异性敲除Znhit1的转基因小鼠模型,在特定的时间点进行取材并进行相关研究,从而也可为明确转录因子Znhit1在视网膜发育中的功能提供一些思路和方法。 方法: 繁殖得到视网膜特异性敲除Znhit1的实验组小鼠Znhit1f/f, Six3-Cre+以及对照组小鼠Znhit1f/f, Six3-Cre-。根据Müller细胞发育以及视网膜整体发育的特点,选取一定的时间点取材,并利用免疫荧光技术进行一系列的实验。(1)利用Müller细胞的特异性抗体GS和Sox9对P14以及5周龄的实验组和对照组小鼠进行共标,探究视网膜特异性敲除Znhit1对Müller细胞的影响。(2)对P7及P10天的两组小鼠进行TUNEL实验;对P0.5、P3及P7天的两组小鼠进行了细胞增殖实验,探究视网膜特异性敲除Znhit1影响Müller细胞的可能机制。(3)利用特异性标记活化的Müller细胞的抗体GFAP对P10、P14以及5周龄的实验组和对照组小鼠进行免疫荧光染色,探究视网膜特异性敲除Znhit1是否可以使Müller细胞产生活化。Six3-Cre的Cre酶主要表达于视网膜的腹侧以及中央区,其背侧以及周边部表达较少。为了便于比较,在区分背腹侧的基础上,我们将两侧视网膜三等分,分别记作C1、C2、C3区。 结果: 1.视网膜特异性敲除Znhit1对Müller细胞的影响 (1) P14天的实验组小鼠不论是背侧还是腹侧,其C1区的Müller细胞形态不规则,结构紊乱,并发生了迁移;其C2、C3区的Müller细胞发生了迁移。(2)5周龄实验组小鼠不论是背侧还是腹侧,其C1区的Müller细胞均缺失;腹侧视网膜C2区的Müller细胞缺失、C3区有极少数Müller细胞(但是结构紊乱、发生了迁移);背侧视网膜C2、C3区的Müller细胞形态不规则并发生了迁移。 2.细胞凋亡实验以及细胞增殖实验 (1) P7天以及P10天的实验组小鼠的Müller细胞的凋亡数量与对照组相比在腹侧都是有所增多的,并具有统计学意义,而背侧的增多没有统计学差异。 (2) P0.5天的实验组小鼠的Ki67染色结果不论是背侧还是腹侧,其C1、C2、C3区均有所减弱。P3天的Ki67染色结果不论是背侧还是腹侧,实验组与对照组细胞增殖情况无明显差异。P7天的实验组小鼠的Ki67染色结果不论是背侧还是腹侧,其C1、C2区细胞增殖情况都较对照组明显;而不论背侧还是腹侧,其C3区的细胞增殖情况,两组无明显差异。 3.视网膜特异性敲除Znhit1使Müller细胞产生了活化 (1) P10天的实验组小鼠不论是背侧还是腹侧,Müller细胞都没有发生活化;而且只有C1区的Müller细胞还存在轴突;C2区和C3区Müller细胞的轴突消失。(2) P14天的实验组小鼠不论是背侧还是腹侧,其C1区及C2区的Müller细胞都发生了活化,并且腹侧比背侧明显;而C3区,不论是背侧还是腹侧Müller细胞没有发生活化,且轴突消失。(3)5周龄实验组小鼠不论是背侧还是腹侧Müller细胞都发生了活化,并且腹侧比背侧明显。 结论: 1.视网膜特异性敲除Znhit1可以导致视网膜Müller细胞结构紊乱、数量减少,并使其发生迁移。 2.视网膜特异性敲除Znhit1可以促使Müller细胞发生细胞凋亡。 3.视网膜特异性敲除Znhit1可以抑制P0.5天视网膜细胞的细胞增殖。 4.对于Müller细胞来说,视网膜特异性敲除Znhit1是个应激因素,可以使其产生活化。