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背景随着生活水平提高,糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)发病率呈逐年上升趋势。而近年来研究证明成体干细胞对治疗糖尿病动物模型具有良好效果,为临床治疗DM提供了一种新的治疗手段。经血源性子宫内膜干细胞(Menstrual blood-derived Endometrial Stem Cells,MenSCs)因其来源丰富、免疫原性低、多向分化潜能高且无致瘤性等特点受到关注。而目前常规MenSCs的分离提取需借助淋巴细胞分离液,分离成本较高,分离时间较长,因此本实验通过直接裂解法优化MenSCs提取效率、提高样本使用效率,并有效缩短提取时间;进一步通过优化现有糖尿病动物模型方法,建立高效、稳定的糖尿病大鼠模型,为深入研究MenSCs在糖尿病临床治疗中的潜在作用机制提供可靠的技术支持。第一部分Ⅱ型糖尿病大鼠模型的建立与评价目的1.明确少量多次注射链脲佐菌素(STZ)及高脂饮食对大鼠Ⅱ型糖尿病模型的构建及稳定性的影响,从而为建立高成功率、稳定的大鼠Ⅱ型糖尿病模型提供借鉴。2.通过分析临床糖尿病患者血生化指标,进一步佐证本实验所建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型与人类糖尿病患者的相似性。方法1.连续4周给予雄性SD大鼠特殊高脂饮食诱导胰岛素抵抗,分别在d28、d35、d42给予腹腔注射浓度为30mg/kg的STZ,继续高脂饮食喂养至d49天,将高脂饮食喂养大鼠组随机分为高脂饮食组和正常饮食组。检测各组大鼠血糖、空腹血糖和糖耐量的变化,进一步检测各组胰岛素、血脂、肝肾功能的生理生化指标,评价模型构建的效果及稳定性。2.收集临床糖尿病患者血生化等相关资料利用SPSS 11.0软件作统计分析。结果1.STZ连续注射三周后,高脂饮食饲养组大鼠全部达到糖尿病诊断标准,而持续高脂饮食饲养组糖尿病症状稳定,且肝、肾功能受损情况逐渐加重;但d49天更换正常饮食饲养组大鼠各项指标均发生显著变化,血糖、血脂及肝、肾功能指标趋近于对照组大鼠。2.通过统计分析,证明本实验所建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型生化指标与临床糖尿病患者血生化指标基本吻合。结论通过高脂饮食饲养结合连续三周给予三次小剂量腹腔注射STZ可成功建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型,而持续高脂饮食饲养可保持动物模型的稳定性,以及结合临床资料分析,进一步证明本实验所建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型接近于临床患者发病症状,为探究糖尿病发病机制的基础研究提供可靠的动物模型。第二部分经血源性子宫内膜干细胞的分离方法优化目的选用健康女性经血作为材料,分别利用传统的密度梯度离心法和红细胞裂解法提取MenSCs,比较两种方法的分离时间和分离效率,为建立一种MenSCs分离提取时间的高效性以及提高样本的极大利用率的方法。方法在月经周期的前几天,健康女性志愿者利用月经杯(Divacup)采集经血样本30ml,并在同等条件下分为A组及B组,每组15ml,于4℃条件下保存,在48h内进行原代细胞分离提取。A组样品离心后,加入6-10倍细胞体的红细胞裂解液裂解沉淀中的红细胞,收集细胞沉淀,接种于细胞培养瓶中;B组样品常规方法提取,密度梯度离心后,收集白膜层,PBS洗涤后,接种于细胞培养瓶中。MTT法和流式细胞仪检测两种方法分离的MenSCs第3、9和18代(P3、P9、及P18代)细胞增殖活性及成体干细胞表面标志物表达情况,并对比两种方法分离时间及分离效率的差异。结果两种不同的方法分离培养的MenSCs均阳性表达成体干细胞表面标志物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105,阴性表达造血干细胞表面标志物CD45和CD34,同时阳性表达HLA-ABC,阴性表达HLA-DR;且两种不同方法分离培养的MenSCs在增殖活性上无统计学差异。但红细胞裂解法比传统的密度梯度离心法分离时间更短,分离效率更高。结论两种MenSCs分离培养方法均满足成体干细胞的鉴定标准,且在生物学特性上未见显著差异,但红细胞裂解法提取细胞成本低,效率高,可为MenSCs的基础及临床研究节约时间及成本。