家蚕微粒子病荧光定量PCR检测技术研究

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家蚕微粒子病作为产业中唯一的检疫对象,其检测技术备受重视。目前生产中以光学显微镜检测技术为检疫实验手段,该技术或基于该技术的检疫评判存在诸多不足,由此基于免疫学和分子生物学的检测技术研发得到关注。已有大量研究表明PCR检测技术是一种诸多性能优于光学显微镜检测的检疫实验手段,但针对蛾或卵等实际样本是否可行,有待大量的科学试验进行证实。为此,本研究开展了基于荧光定量PCR检测技术检测蚕卵的相关试验,主要结果如下。  1、以纯化家蚕微粒子虫孢子为检测对象,常规提取核酸,针对小亚基核糖体的Nb-ssu1092F和Nb-ssu1227R为引物,质粒及家蚕微粒子虫DNA为标准曲线标准品,建立了反应体系为20μL的荧光定量PCR检测法,其灵敏度为0.1颗家蚕微粒子虫孢子。  2、蚕卵和家蚕微粒子虫孢子不同数量混合的两因素荧光定量PCR检测试验结果为:家蚕微粒子虫孢子数为107颗时,与13颗或以上蚕卵混合后无检测信号;孢子数为104颗以上时,与7颗蚕卵混合后可检出,但Ct值极显著高于纯化孢子阳性对照(P=0.004);孢子数为102颗以上时,与4颗蚕卵混合后的检测Ct值与纯化孢子阳性对照无显著差异(P=0.871)。即蚕卵对家蚕微粒子虫的荧光定量PCR检测有显著影响,但减少蚕卵数量可消除其影响。  3、该检测法对单粒蚕卵中混入家蚕微粒子虫孢子的检测灵敏度为10颗,变异系数小于5%;对感染母蛾所产蚕卵的单粒检测比较试验显示其检出率显著高于光镜检测法(P=0.000)。  4、感染母蛾所产蚕卵经即时浸酸后催青,取不同时间(催青24h和72h,转青卵,未食桑蚁蚕和孵化后七天蚁蚕)的样本进行荧光定量PCR检测的结果表明:检出率未见明显差异,但检测强度孵化后七天蚁蚕样本极显著高于其它样本(P=0.000),其它样本间无显著差异(P>0.05)。
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