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MicroRNA (miRNA)是一类分布广泛,大小约为22个核苷酸的内源性非编码RNA,参与蛋白质编码基因的转录后调控。目前,对miRNA基因转录的了解仍十分有限,一般认为内含子区域的miRNA及其与宿主基因共转录,而基因间区的miRNA则独立转录,拥有自己的启动子。本论文主要研究黑腹果蝇Drosophila melanogaster基因间区miRNA的转录,解析miRNA的基因结构,检测miRNA的基因启动子活性,搜寻启动子区motif并进行启动子预测软件的评估。本项研究对更好地理解复杂的miRNA基因的转录水平调控,具有重要的意义。一、果蝇基因间区pri-miRNA基因的扩增及全长克隆采取“开源节流”策略,应用RNAi技术干扰pri-miRNA加工成熟的关键核酸酶Drosha,辅以CuSO4刺激,达到了提高pri-miRNA转录本丰度的目的。进一步利用RACE技术克隆果蝇基因间区pri-miRNA转录本,获得bantam、mir-276a、mir-277和mir-8的5’末端,其中mir-276a和mir-277均含有两个TSS,而mir-8的2个不同的5’RACE克隆具有选择性剪接,指向同一个5’末端；同时克隆到bantam、mir-2b-1、mir-10、mir-276a和mir-277的3’末端,且mir-10具有两个poly(A)尾巴。通过以上工作,拼接出pri-bantam、pri-mir-276a、pri-mir-277的全长转录本。二、果蝇pri-miRNA的基因结构经过end-to-end PCR验证.结果表明pri-bantam全长2054nt.转录起始位点(TSS)“G”距离pre-bantam的5’末端992nt,而且意外的是pri-bantam含有5个内含子,pre-bantam位于第一个长内含子中,第四个内含子也保留于pri-bantam转录本。另外,pri-mir-276a和pri-mir-277转录本全长分别1632nt和1300nt,并且均含有多个5’末端。克隆的所有3’端都包含一串连续“A”,并有多聚腺苷酸加尾信号(polyA signal, AATAAA)。此外,mir-8的5’端含有一个选择性剪切的内含子,mir-10具有多个polyA尾巴。以上特征都是典型的RNA聚合酶II(RNA polymeraseⅡ)转录基因的特征,这暗示pri-miRNA转录本是由polⅡ转录而来。三、果蝇miRNA基因核心启动子的锚定及活性分析初步分析表明,pri-bantam上游27bp处有一个标准的TATA盒子,而mir-276a、mir-277和mir-8不具有这个结构。Pri-mir-276a和pri-mir-277的两个TSS,意味着可能有两个核心启动子区。利用非磷酸化的RNA聚合酶Ⅱ的抗体(anti-PolⅡa,8WG16)进行体内的染色质免疫共沉淀分析(Chromatin Immunoprecipitation assay, ChIP). ChIP实验证实了这些miRNA的核心启动子区可以被RNA聚合酶Ⅱ(polⅡ)结合。进一步,将miRNA基因(mir-276a, bantam)的核心启动子克隆到荧光素酶报告基因载体上游,并转染至果蝇S2细胞中,结果表明启动子能成功驱动荧光素酶基因的表达,显示出polⅡ启动子活性,表明大部分miRNA是由polⅡ负责转录的。四、果蝇miRNA基因启动子区的转录因子结合预测及转录因子Myc免疫共沉淀分析实验的方法找到了果蝇miRNA基因的启动子,进一步利用生物信息学方法预测了区域中的转录因子结合位点(Transcription Factors Binding Sites).一些与果蝇发育调控相关的重要转录因子也可能参与到调控miRNA基因的表达,如Kriippel, Hunchback, Giant和Zeste被预测在bantam的核心启动子区。同时miRNA可能会被一些共同的转录因子调控。另外,针对癌基因c-Myc转录因子,用抗c-Myc抗体进行染色质免疫共沉淀(ChIP)实验,结果显示c-Myc可以结合到bantam、mir-277和mir-8的启动子区,但是不能结合到mir-276a的启动子区,表明c-Myc的确可能参与调控众多miRNA基因的表达。五、pri-miRNA基因的motif与启动子预测软件评估寻找miRNA基因的顺式调控元件(cis-regulating elements),有助于鉴别miRNA基因的特征。运用生物信息软件分析了miRNA基因上游的motif,并将找到的这些motif和已知的TRANSFAC及JASPAR数据库做了比较,表明miRNA基因启动子区motif可能具有调控miRNA基因表达的重要功能。目前启动子／TSS预测软件大都是针对蛋白质编码基因的,尚未有针对miRNA基因的软件或算法。综合已报道证实的线虫、大鼠、小鼠、人等其他物种pri-miRNA基因序列,对目前使用比较广泛的启动子预测软件McPromoter, TSSG, TSSW, Promoter 2.0, PromoterScan和NNPP2.2等进行了初步评估。