近年来,纳米材料广泛应用于人们的生产和生活中,包括生物医学试剂、化妆品、油漆、食品添加剂和汽车工业等多个方面。纳米颗粒（NPs）可以通过多种途径进入人体,由于其较小的粒径,其易跨过生物屏障并分布于全身,NPs与血液成分的相互作用不可避免并且具有潜在威胁,红细胞（RBC）是血液中的主要细胞,NPs一旦进入循环系统,可直接与红细胞相互作用,诱导红细胞发生溶血以及衰亡,对红细胞的生理活性产生一系列的影响。当环境中的NPs进入人体后,NPs也会立即被周围生物环境中所含的蛋白质包裹,在NPs表面形成“蛋白冠（Protein corona,PC）”,赋予NPs新的生物学身份。目前,NPs与人体接触的途径在不断增加,而有关NPs在生物体形成蛋白冠及其对红细胞毒性效应的研究还比较少。因此本研究选用无定型二氧化硅纳米颗粒（SiO2 NPs）为纳米颗粒研究模型,对其诱导的红细胞衰亡效应及具体机制进行探究,并且还评估了体液环境中不同蛋白冠的包裹对红细胞的损伤作用。本研究对了解环境中NPs的血液毒性提供了参考,也为纳米材料的安全评价及生物学应用奠定基础。第一部分:本部分研究工作通过体外和体内实验评估了SiO2 NPs诱导的红细胞衰亡效应,并且对比了聚乙烯吡咯烷酮（PVP）与血浆蛋白在SiO2 NPs表面修饰后对红细胞的毒性差异。本研究结果证实SiO2 NPs可诱导红细胞衰亡,强调了蛋白冠以及NPs表面接枝聚合物的保护作用。研究发现,SiO2 NPs在包裹血浆蛋白和大分子PVP后,材料表面会形成一层有厚度的蛋白层或大分子层,SiO2 NPs粒径明显增大,表明表面蛋白冠以及大分子的成功包裹。裸露的SiO2 NPs会诱导红细胞磷脂酰丝氨酸外翻以及溶血,且随着血红蛋白的流出,衰亡的红细胞会被巨噬细胞吞噬降解。而包裹了血浆蛋白和PVP的SiO2 NPs不会引起红细胞的衰亡,并且不会诱导红细胞被巨噬细胞吞噬。SiO2 NPs和红细胞作用的TEM图像表明裸露的SiO2 NPs可以使红细胞膜破损,从而造成胞内物质流出;而大分子包裹的SiO2NPs不会与红细胞膜接触,只是分布在红细胞间隙里,保护了细胞膜的完整性,这意味着SiO2 NPs诱导的红细胞衰亡可能是由于红细胞膜被直接破坏,蛋白冠或PVP覆盖通过阻止SiO2 NPs与红细胞的直接接触来减少红细胞损伤。此外,在本研究中还探讨了SiO2 NPs诱导红细胞衰亡几种触发因素,以进一步阐明SiO2 NP的诱导红细胞衰亡效应的可能机制。研究将不同浓度的SiO2 NPs（0、2.5、5、10、20、40μg/ml）与红细胞进行孵育,发现红细胞的活性氧（ROS）释放量随SiO2 NPs浓度升高而增多,同时氧化应激指标也发生了相应的变化。说明在SiO2 NPs的刺激下,红细胞产生ROS,诱发氧化应激,触发过氧化反应,红细胞的抗氧化活性随着材料浓度的增加也有所升高。另外研究还发现:在SiO2 NPs和红细胞孵育过程中,胞内钙离子浓度上升,然而在无钙的环境中孵育,红细胞衰亡得到显著缓解,说明钙离子是SiO2 NPs诱导红细胞衰亡的重要诱因。同时,研究发现Ca2+内流的同时,胞内K+浓度随SiO2 NPs浓度上升而下降,猜测可能是SiO2 NPs使得Ca2+敏感的K+通道活化,K+外流,细胞膜超级化,从而使细胞失水皱缩。最后,还发现随着SiO2 NPs浓度升高,血小板活化因子受体表达增加,并且神经酰胺的含量有显著地上调,猜想神经酰胺也是SiO2 NPs诱导红细胞衰亡中的关键分子。本研究还进一步评估了SiO2 NPs的体内毒性。小鼠体内单次给药发现SiO2NPs（20 mg/kg）并没有引起明显的红细胞损伤,这种现象可能是由于裸露的SiO2NPs一旦进入血液循环,表面就会迅速形成蛋白冠,随后快速被清除。而给药七天后发现SiO2 NPs组的红细胞有了明显地损伤,出现了磷脂酰丝氨酸外翻,ROS释放和钙离子内流等现象,发生了红细胞衰亡,可能是因为长期给药使小鼠体内SiO2 NPs蓄积,从而对红细胞产生了毒性,但其具体机制还有待进一步研究。本章结果表明,SiO2 NPs可以通过直接与红细胞膜接触诱导红细胞衰亡,并且会使细胞膜破碎从而造成内容物流出,而小鼠血浆和PVP的包裹通过阻隔SiO2NPs和红细胞的直接接触来抑制红细胞衰亡。此外,氧化应激、胞内Ca2+和神经酰胺都是SiO2 NPs作用导致红细胞衰亡发生的重要诱因。第二部分:本部分研究工作发现包裹了小鼠血清蛋白冠的SiO2 NPs（SiO2@MS）可以通过形成补体攻膜复合物C5b-9来诱导红细胞衰亡,引起红细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻。为了研究SiO2 NPs激活补体的机制,本研究将SiO2 NPs与小鼠血清进行孵育,用LC-MS/MS鉴定SiO2 NPs表面血清蛋白冠中的补体相关蛋白种类及丰度,还使用蛋白质印迹法（Western Blot）检测不同补体激活通路的标志物表达情况,发现经典途径标志物C1q和替代途径标志物B因子均有不同程度地表达,而凝集素标志物MBL无任何表达。同时,还分别使用经典途径抑制剂（C1NH）和替代途径抑制剂（LNP023）作用进一步证明两个途径在SiO2 NPs诱导补体激活中发挥的作用。此外,在实验中还发现SiO2 NPs诱导补体激活后红细胞的IL-6、IL-1β、TNF-α等炎症因子水平都有显著上调,说明可以SiO2 NPs诱导红细胞发生炎症反应。本章结果表明,SiO2 NPs所诱导的补体激活是通过补体经典途径和替代途径来发生的,最终在红细胞上形成攻膜复合物C5b-9,诱导红细胞衰亡,并且还诱导红细胞的炎症反应发生。以上实验结果表明,SiO2 NPs能通过与红细胞直接接触使细胞内容物流出,诱导红细胞溶血以及衰亡发生,使红细胞膜上磷脂酰丝氨酸外翻、细胞骨架改变以及输氧能力下降。此外,氧化应激、胞内Ca2+和神经酰胺都是SiO2 NPs作用导致红细胞衰亡发生的重要诱因。并且小鼠血浆蛋白冠的包裹以及大分子聚合物的接枝可以通过阻隔SiO2 NPs和红细胞的直接接触来抑制红细胞衰亡,但是SiO2 NPs血清冠中的补体成分可以通过激活补体级联反应形成攻膜复合物,诱导红细胞衰亡和炎症发生。