论文部分内容阅读
目的：探讨铅是否诱导人肾近曲小管上皮细胞(HK-2)凋亡，并进一步研究铅诱导HK-2细胞凋亡的途径，为预防和治疗铅性肾病提供实验依据和理论基础。方法：以不同浓度的铅(0、50、100、200、400μmol／L)与HK-2细胞共培养48h作量效分析；以400μmol／L铅与HK-2细胞共培养(0、12、24、48h)作时效分析：平板克隆实验法检测细胞活力；Hochest33258荧光染色检测细胞凋亡形态学改变；Annexin-V(FITC)／PI双染法结合流式细胞仪分析细胞凋亡率；荧光化学分光仪分析caspase-3、-8、-9(半胱天冬酶-3、-8、-9)的活性变化；流式细胞仪检测检测细胞色素c(Cyt c)的释放；Western bolt检测caspase-3、-9、bcl-2、bax蛋白的表达。实验结果用SPSS13.0软件进行统计分析。结果：1．平板克隆实验结果显示：铅可抑制HK-2细胞生长活力，随着铅浓度的增高及染毒时间的延长，细胞生长活力越低(p＜0.05，p＜0.01)；2．Hochest33258荧光染色观察到铅使HK-2细胞胞体缩小、胞浆浓缩、核染色质聚集、核固缩、核碎裂等典型的凋亡形态学改变；3．铅呈剂量依赖性和时间依赖性诱导细胞凋亡。50、100、200、400μmol／L铅染毒48h后，凋亡率分别为4.35％±1.08％、13.39％±0.53％、18.09％±2.54％、30.85％±0.93％，400μmol／L染毒12、24、48h后，凋亡率分别为5.36％±1.38％、14.38％±1.05％、31.08％±1.94％(p＜0.05，p＜0.01)；4．流式细胞术结果显示．铅诱导Cyt c从线粒体释放入胞浆，释放量呈剂量依赖性和时间依赖性增高(p＜0.05，p＜0.01)；5．铅使caspase-3、caspase-9的活性增强(p＜0.05，p＜0.01)，但对caspase-8的活性无明显影响；6．caspase-3抑制剂可明显抑制铅诱导的caspase-3的活化，并抑制铅诱导的HK-2细胞凋亡；7．Western bolt结果显示，铅使caspase-3、caspase-9表达增高，bcl-2蛋白表达降低，bax蛋白表达增高。结论：1．一定剂量范围内，铅可导致HK-2细胞损伤；2．铅诱导HK-2细胞凋亡；3．铅诱导HK-2细胞凋亡的可能机制是铅损坏HK-2细胞线粒体膜，导致Cyt C的释放，激活caspase-9，再激活caspase-3，进而引起caspase酶依赖性细胞凋亡；4．铅上调HK-2细胞促凋亡蛋白bax的表达，同时下调抑制凋亡蛋白bcl-2的表达。