论文部分内容阅读
目的:探讨铅是否诱导人肾近曲小管上皮细胞(HK-2)凋亡,并进一步研究铅诱导HK-2细胞凋亡的途径,为预防和治疗铅性肾病提供实验依据和理论基础。方法:以不同浓度的铅(0、50、100、200、400μmol/L)与HK-2细胞共培养48h作量效分析;以400μmol/L铅与HK-2细胞共培养(0、12、24、48h)作时效分析:平板克隆实验法检测细胞活力;Hochest33258荧光染色检测细胞凋亡形态学改变;Annexin-V(FITC)/PI双染法结合流式细胞仪分析细胞凋亡率;荧光化学分光仪分析caspase-3、-8、-9(半胱天冬酶-3、-8、-9)的活性变化;流式细胞仪检测检测细胞色素c(Cyt c)的释放;Western bolt检测caspase-3、-9、bcl-2、bax蛋白的表达。实验结果用SPSS13.0软件进行统计分析。结果:1.平板克隆实验结果显示:铅可抑制HK-2细胞生长活力,随着铅浓度的增高及染毒时间的延长,细胞生长活力越低(p<0.05,p<0.01);2.Hochest33258荧光染色观察到铅使HK-2细胞胞体缩小、胞浆浓缩、核染色质聚集、核固缩、核碎裂等典型的凋亡形态学改变;3.铅呈剂量依赖性和时间依赖性诱导细胞凋亡。50、100、200、400μmol/L铅染毒48h后,凋亡率分别为4.35%±1.08%、13.39%±0.53%、18.09%±2.54%、30.85%±0.93%,400μmol/L染毒12、24、48h后,凋亡率分别为5.36%±1.38%、14.38%±1.05%、31.08%±1.94%(p<0.05,p<0.01);4.流式细胞术结果显示.铅诱导Cyt c从线粒体释放入胞浆,释放量呈剂量依赖性和时间依赖性增高(p<0.05,p<0.01);5.铅使caspase-3、caspase-9的活性增强(p<0.05,p<0.01),但对caspase-8的活性无明显影响;6.caspase-3抑制剂可明显抑制铅诱导的caspase-3的活化,并抑制铅诱导的HK-2细胞凋亡;7.Western bolt结果显示,铅使caspase-3、caspase-9表达增高,bcl-2蛋白表达降低,bax蛋白表达增高。结论:1.一定剂量范围内,铅可导致HK-2细胞损伤;2.铅诱导HK-2细胞凋亡;3.铅诱导HK-2细胞凋亡的可能机制是铅损坏HK-2细胞线粒体膜,导致Cyt C的释放,激活caspase-9,再激活caspase-3,进而引起caspase酶依赖性细胞凋亡;4.铅上调HK-2细胞促凋亡蛋白bax的表达,同时下调抑制凋亡蛋白bcl-2的表达。