纤维素是地球上最丰富的可再生的自然生物资源,而来源于低成本的可再生性纤维素资源的生物制品和生物能源对于人类的可持续发展又是非常重要的,利用纤维素酶的降解作用进行纤维素的生物转化有着广阔的前景。随着基因工程技术的发展,利用基因工程技术将纤维素酶的基因克隆到细菌、酵母、真菌和植物中以期得到高比活力的重组型纤维素酶。放线菌可产生较为完整的纤维素酶体系,且很多是耐热的。由于酶的耐热性在生产中具有实用意义,所以耐热菌成为研究的热点。本试验克隆了蚀木链霉菌中的耐热纤维素酶基因,并在大肠杆菌中进行表达,以期得到产生高酶活力重组型纤维素酶的工程菌。根据从国际基因库(GenBank)中下载的多条纤维素酶基因序列设计简并引物,采用PCR方法扩增纤维素酶基因,将回收的基因片段连接到用pMD-18T载体上,进行测序分析。结果表明该全长肽基因读码框大小为1140bp,编码379个氨基酸。对氨基酸序列的在线分析表明,在N端具有信号肽。根据该纤维素酶基因的结构特征和信号肽分析,构建了全长基因和成熟肽的pET-28a重组载体,分别转化到受体菌大肠杆菌Rosetta(DE3),在IPTG诱导下进行表达。表达产物经SDS-PAGE电泳后,分别得到分子量为39 kD和42 kD左右的两条特异表达条带。收集诱导表达的菌体用PBS洗涤后,经反复冻融,采用DNS法对于处于不同位置的表达产物进行酶活力分析。发现含有重组质粒pET-28a/celKX-ns的工程菌所表达出来的蛋白主要是以包涵体形式存在,虽有部分可溶,但酶活性极低。而pET-28a/celKX表达的目的蛋白在破碎后的上清和培养基组分中的酶活都很高,分泌到培养基中的耐热内切纤维素酶占有活性的总酶量的80.3%,真正实现了胞外可溶性和有活性蛋白质高效的表达,优化诱导表达条件后,胞外酶活可达3.211IU/mL。表达产物酶学性质研究表明:表达产物反应的最适温度分别为55℃,最适pH分别为5.5。表达产物具有很好的热稳定性和pH稳定性。结果初步表明,重组的大肠杆菌产生的耐热中性内切纤维素酶为中性纤维素酶,具有较高的酶活力,在纺织工业潜在的应用价值。