基于分子印迹技术的糖蛋白识别与检测新方法研究

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糖蛋白在生物体中发挥着重要的作用,如分子识别、信号传导、细胞黏附、免疫应答等。糖蛋白结构和表达量的异常变化会影响生物体的免疫系统,与炎症、肿瘤和先天性疾病的发生、发展密切相关,故许多糖蛋白被用作疾病标志物在临床诊断中使用。此外,糖蛋白激素,如促红细胞生成素(EPO)等,因其可快速提高竞技成绩而被运动员滥用为兴奋剂,已被世界反兴奋剂组织列为违禁药品。然而,许多重要的糖蛋白在生物样品中的丰度很低,并伴随着高丰度干扰物的干扰,使得复杂生物样品中低丰度糖蛋白的分析和检测具有很大的挑战性。因此,建立能应用于复杂实际样品中痕量糖蛋白的专一、灵敏分析方法具有重要的科学意义和应用价值。  分子印迹技术已经发展成为制备能专一识别蛋白质的亲和材料的重要技术。特别是,本课题组已经发展出一系列制备识别糖蛋白的分子印迹聚合物的高效方法,并在疾病诊断和细胞成像等领域取得了成功应用。另一方面,拉曼光谱和质谱是检测和鉴定微量甚至是痕量蛋白质的重要手段。针对目前糖蛋白分离分析方法存在的问题,本论文将分子印迹技术分别与表面等离激元拉曼散射、基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱相结合,建立快速、便捷、高效的糖蛋白识别及分析方法。  首先,我们发展出能专一、灵敏、快速地分析复杂实际样品中痕量糖蛋白的等离激元增强免疫分析法。该方法将硼亲和分子印迹聚合物的高识别专一性和等离激元增强拉曼散射(PERS)的高灵敏度相结合,无需使用抗体和酶等价格昂贵和稳定性差的生物分子。以人体尿样中的EPO为例,我们制备出印迹了EPO的分子印迹阵列和相应的高灵敏拉曼探针。分子印迹阵列能专一结合样品中的痕量EPO,后者经硼亲和拉曼探针标记后,在印迹阵列上形成分子印迹聚合物-EPO-拉曼探针三元复合物结构。由于分子印迹阵列以金薄层为基底,在激光照射下金层产生的表面等离子波能显著增强拉曼探针的拉曼信号,从而提供超高的检测灵敏度,检测灵敏度可达2.94×10-14M(信噪比为4)。由于拉曼检测的信号响应与样品浓度间的关系为非线性,这使得基于拉曼光谱的定量分析十分困难。为了解决该问题,我们提出了一个新颖的标准加入法,使得定量分析成为可能。利用该方法,我们成功定量分析了人体尿样中的EPO,为疾病诊断和兴奋剂检测中的EPO测定提供了新颖的分析方法。  其次,我们初步尝试了将印迹聚合物靶板在线富集-基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)联用。利用硼亲和表面定向印迹技术,制各了糖蛋白印迹聚合物修饰靶板,初步展示了对实际样品中的糖蛋白的在线识别抓取及快速质谱检测能力。
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