目的:从整体、细胞和分子水平,研究针刺对坐骨神经损伤的治疗机制。分别通过观察神经运动功能和组织形态结构、血清和神经氧化损伤标志物表达、JNK信号通路介导的凋亡相关蛋白和雪旺细胞特异性标志蛋白表达,探索针刺对坐骨神经损伤大鼠神经修复的效果及其作用机制。同时通过观察RSC96细胞系细胞周期和细胞凋亡改变、JNK信号通路介导的凋亡相关蛋白表达,进一步探索针刺后血清效应物质对氧化损伤的雪旺细胞的保护效果和作用机制。材料与方法:1体内动物实验（论文一至论文三）1.1动物分组与造模SPF级SD大鼠70只,分为假手术组（SHAM）、模型组（SNCI）、浅刺组（SEA）、深刺组（DEA）和非穴深刺组（NEA）,每组14只。除SHAM组外,其余4组采用经典钳夹法制备大鼠坐骨神经挤压性损伤模型。1.2干预方法造模1天后各组按照相应干预措施开始针刺治疗。SEA和DEA两组选取造模同侧的“环跳”穴作为治疗部位,SEA组针刺入约0.5cm,深度以触及进针部位下方的肌肉组织为宜;DEA组刺入约1.5cm,深度以触及神经干为宜。NEA组选取造模同侧“环跳”穴与膝关节外侧缘连线上,约损伤处远侧端1cm处作为治疗部位,刺入深度约1.5cm以触及神经干为宜。各组均小幅度提插捻转3次后连接电针仪正极,尾部连接负极。采用疏密波,频率2.0Hz、电流2.0m A,每日1次,每次20min,连续治疗14天。1.3取材和指标检测取材前对所有实验大鼠进行坐骨神经运动功能评价,之后在麻醉状态下进行神经电生理检测,腹主动脉取血用于ELISA法检测血清中SOD、MDA、8-OHd G水平。过量麻醉处死大鼠后,分别取坐骨神经和背根神经节,其中1只大鼠所取的神经组织于2.5%戊二醛中固定,用于透射电子显微镜下观察组织超微结构;3只大鼠所取的神经组织于4%多聚甲醛中固定,用于免疫组化法观察S100蛋白表达、免疫荧光法观察p-JNK、p-c-Jun、Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-8蛋白表达;其余大鼠所取的组织-80℃冻存,用于ELISA法检测神经中SOD、MDA、8-OHd G水平;RT-PCR法检测JNK、c-Jun、Bcl-2、Bax、caspase-8、caspase-3 m RNA表达;Westernblot法检测p-ERK、p-p38、p-JNK、TNF-α、p-c-Jun、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-8、S100蛋白表达。2体外细胞实验（论文四）2.1针刺血清制备与细胞分组15只SD大鼠分为空白组和治疗组,空白组10只,治疗组5只,空白组大鼠造模方法和干预方法同体内实验SHAM组一致,治疗组大鼠造模方法和干预方法同体内实验深刺组一致,连续治疗14天,末次治疗后0.5h行腹主动脉取血,分离血清灭活滤过制备针刺血清。细胞根据诱导和干预条件不同,分为3组,分别是对照组（Control）、模型组（H₂O-₂）和针刺血清组（H₂O-₂+Acupuncture serum）。2.2细胞培养和干预条件筛选复苏RSC96细胞系,进行常规传代培养,培养至第3代,采用CCK-8法筛选H₂O-₂诱导细胞凋亡和针刺血清干预细胞的条件。2.3指标检测采用流式细胞仪和Annexin V/PI双染法检测细胞周期和细胞凋亡水平;ELISA法检测细胞上清液中TNF-α表达水平;免疫荧光法检测S100、Cleaved caspase-3蛋白表达;加入JNK抑制剂SP600125后,Westernblot法检测p-JNK、p-c-Jun、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-8、Cleaved Caspase-3蛋白表达。结果:一、体内动物实验论文一针刺“环跳”穴对坐骨神经损伤模型大鼠神经功能、形态修复及氧化损伤的实验研究1实验大鼠坐骨神经运动功能评价钳夹法制备挤压损伤大鼠坐骨神经功能指数（SFI）显著下降（P<0.01）。治疗后,与SNCI组比较,SEA、DEA两组SFI存在显著上升（P<0.01）,DEA组上升程度高于SEA组（P<0.01）。2实验大鼠坐骨神经电生理检测钳夹法制备挤压损伤大鼠运动神经传导速度（MNCV）显著下降（P<0.01）。治疗后,与SNCI组比较,SEA、DEA两组MNCV存在显著上升（P<0.01）,DEA组上升程度高于SEA组（P<0.05）。3实验大鼠坐骨神经组织超微结构观察SHAM组神经髓鞘和雪旺细胞结构完整。SNCI组髓鞘结构变形,完整雪旺细胞消失,出现少量无髓神经纤维。SEA组神经髓鞘结构恢复,但是排列松散,存在板层分离;DEA组神经髓鞘结构较为完整,可见髓鞘厚度不均的有髓神经纤维和大量雪旺细胞增生。NEA组神经髓鞘结构恢复较差,几乎未见雪旺细胞。4实验大鼠背根神经节组织超微结构观察各组背根神经节超微结构未见明显异常,髓鞘结构基本完整,髓鞘边缘可见结构完整的雪旺细胞。5针刺“环跳”穴对大鼠血清氧化损伤标志物的影响与SHAM组比较,SNCI组SOD水平显著降低（P<0.01）。与SNCI组比较,SEA、DEA组SOD水平显著升高（P<0.01）,DEA组SOD水平高于SEA组（P<0.01）。与SHAM组比较,SNCI组MDA、8-OHd G水平显著升高（P<0.01）。与SNCI组比较,SEA、DEA组MDA、8-OHd G水平显著降低（P<0.01）,DEA组MDA、8-OHd G水平低于SEA组,NEA组MDA、8-OHd G水平低于SNCI组但远高于SEA、DEA组（P<0.01或P<0.05）。6针刺“环跳”穴对大鼠坐骨神经氧化损伤标志物的影响与SHAM组比较,SNCI组SOD水平显著降低（P<0.01）。与SNCI组比较,SEA、DEA组SOD水平显著升高（P<0.01）,DEA组SOD水平高于SEA组（P<0.01）。与SHAM组比较,SNCI组MDA、8-OHd G水平显著升高（P<0.01）。与SNCI组比较,SEA、DEA组MDA、8-OHd G水平显著降低（P<0.01）,DEA组MDA、8-OHd G水平低于SEA组（P<0.01）,NEA组MDA水平低于SNCI组但远高于SEA、DEA组（P<0.01）,NEA组8-OHd G水平低于SNCI组（P<0.01）,但高于DEA组（P<0.01）。论文二针刺“环跳”穴对坐骨神经损伤模型大鼠JNK信号通路的实验研究1针刺“环跳”穴对大鼠坐骨神经和背根神经节MAPK信号通路的影响坐骨神经组织中,p-ERK蛋白,DEA组表达低于其余4组（P<0.05）,其余4组比较无显著差异。p-p38蛋白,与SHAM组比较,SNCI、SEA、NEA组表达升高（P<0.05）,DEA组蛋白表达降低（P<0.05）;与SNCI、SEA组比较,DEA组表达降低（P<0.05）,NEA组蛋白表达升高（P<0.05）。p-JNK蛋白,与SHAM组比较,其余4组表达均升高（P<0.05）;与SNCI组比较,DEA组蛋白表达降低（P<0.05）。背根神经节组织中,p-ERK蛋白,与SHAM组比较,DEA、NEA组表达升高（P<0.05）。与DEA组比较,NEA组蛋白表达升高（P<0.05）。p-p38蛋白,与SHAM组比较,其余4组表达均升高（P<0.05）;与SNCI组比较,SEA组蛋白表达降低（P<0.05）;与SEA、DEA组比较,NEA组蛋白表达升高（P<0.05）。p-JNK蛋白,与SHAM组比较,SNCI、SEA、NEA组表达升高（P<0.05）;与SNCI、SEA组比较,DEA组蛋白表达降低（P<0.05）、NEA组蛋白表达升高（P<0.05）。2针刺“环跳”穴干预大鼠坐骨神经和背根神经节JNK信号通路对凋亡的影响2.1 RT-PCR法检测大鼠坐骨神经和背根神经节中JNK、c-Jun、Bcl-2、Bax、caspase-8、caspase-3m RNA表达的影响坐骨神经组织中,JNK1 m RNA,与SHAM组比较,SNCI、SEA、NEA组表达显著升高（P<0.05）;与SNCI组比较,DEA组表达显著降低（P<0.05）。JNK2 m RNA各组表达无统计学差异（P>0.05）。JNK3 m RNA,与SHAM组比较,其余4组表达显著升高（P<0.05）,各组之间表达无统计学差异。c-Jun m RNA,与SHAM组比较,其余4组表达显著升高（P<0.05）;与SNCI组比较,DEA组表达显著降低（P<0.05）,SNCI、SEA、NEA之间表达无统计学差异。Bcl-2/Bax m RNA,与SHAM组比较,SNCI、SEA、NEA组表达显著降低（P<0.05）;与SNCI组比较,DEA组表达显著升高（P<0.05）;NEA组表达显著低于SNCI组（P<0.05）。Caspase-3 m RNA,各组表达无统计学差异。Caspase-8 m RNA,与SHAM组比较,其余4组表达显著升高（P<0.05）;与SNCI组比较,其余3组表达显著降低（P<0.05）,其中SEA和NEA无显著差异,DEA组表达低于NEA组（P<0.05）。背根神经节组织中,JNK1 m RNA,与SHAM组比较,SNCI组表达显著升高（P<0.05）;与SNCI组比较,SEA、DEA组表达显著降低（P<0.05）。JNK2 m RNA,与SHAM组比较,SNCI组表达显著升高（P<0.05）;与SNCI组比较,其余3组表达显著降低。JNK3 m RNA,与SHAM组比较,SNCI、SEA、DEA组表达显著升高（P<0.05）;与SNCI组比较,SEA、DEA、NEA组表达显著降低（P<0.05）;与SEA、DEA组比较,NEA组表达显著降低（P<0.05）。c-Jun m RNA,与SHAM组比较,SNCI、SEA组表达显著升高（P<0.05）;与SNCI组比较,SEA、DEA、NEA组表达显著降低（P<0.05）;SEA和NEA组表达无显著差异,DEA组表达低于上述2组（P<0.05）。Bcl-2/Bax m RNA,与SHAM组比较,SNCI、SEA组表达显著降低（P<0.05）;与SNCI组比较,SEA、DEA组表达显著升高（P<0.05）;DEA组表达高于SEA组高于NEA组（P<0.05）。Caspase-3 m RNA,与SHAM组比较,其余四组表达显著升高（P<0.05）;与SNCI组比较,SEA、DEA组表达显著降低（P<0.05）,DEA组表达低于NEA组（P<0.05）。Caspase-8 m RNA,与SHAM组比较,SNCI、SEA、NEA组表达显著升高（P<0.05）;与SNCI组比较,DEA组表达显著降低（P<0.05）,SEA、NEA组与之表达无统计学差异。2.2免疫荧光法检测针刺“环跳”穴对大鼠坐骨神经和背根神经节中p-JNK、p-c-Jun、Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-8蛋白表达的影响坐骨神经组织中,p-JNK蛋白荧光强度各组均较低,组间未见明显差异。p-c-Jun蛋白荧光强度各组均较低,与SHAM组比较,SNCI、NEA组强度明显增加;与SNCI组比较,SEA、DEA组强度明显减少,NEA组强度轻微减少。Bcl-2蛋白荧光强度各组均较低,组间未见明显差异。Bax蛋白荧光强度各组均较高,与SHAM组比较,SNCI、SEA、NEA组强度明显增加;与SNCI组比较,DEA组强度明显减少。Cleaved-caspase-3蛋白荧光强度各组差异较大,SHAM组和DEA组强度较低,SEA和NEA组强度较高,SNCI组强度最高。Cleaved-caspase-8蛋白荧光强度各组差异较大,SNCI组强度很高,其余4组强度较低。背根神经节组织中,p-JNK蛋白荧光强度各组均较低,组间未见明显差异。p-c-Jun蛋白荧光强度各组均较低,SNCI组强度相对较高,其余4组强度较低。Bcl-2蛋白荧光强度各组均较低,组间未见明显差异。Bax蛋白荧光强度各组均较高,与SHAM组比较,SNCI、NEA组强度明显增加;与SNCI组比较,SEA、DEA组强度明显减少。Cleaved-caspase-3蛋白荧光强度各组差异较大,SHAM组和DEA组强度较低,SEA和NEA组强度较高,SNCI组强度最高。Cleaved-caspase-8蛋白荧光强度各组均较低,组间未见明显差异。2.3 Western Blot法检测针刺“环跳”穴对大鼠坐骨神经和背根神经节中TNF-α、p-c-Jun、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-8蛋白表达的影响坐骨神经组织中,TNF-α蛋白,SHAM组表达较低,SNCI组表达增加（P<0.05）,DEA组较SNCI组表达减少（P<0.05）。Bcl-2/Bax蛋白比值,与SHAM组比较,SNCI组能显著降低（P<0.05）,SEA和DEA显著增加（P<0.05）,DEA组优于SEA组（P<0.05）。p-c-Jun蛋白,SHAM、SNCI、SEA和NEA组表达无统计学差异,DEA组表达减少（P<0.05）。Cleaved Caspase-3蛋白,与SHAM组比较,SNCI和NEA组显著增加（P<0.05）,SEA和DEA显著减少（P<0.05）,DEA组优于SEA组（P<0.05）。Cleaved Caspase-8蛋白,与SHAM组比较,SNCI组显著增加（P<0.05）,SEA和DEA组显著减少（P<0.05）。背根神经节组织中,TNF-α蛋白,SHAM组表达较低,SNCI组表达增加（P<0.05）,DEA组较SNCI组表达减少（P<0.05）。Bcl-2/Bax蛋白比值,与SHAM组比较,SNCI组显著降低（P<0.05）,SEA和DEA显著增加（P<0.05）,DEA组优于SEA组（P<0.05）。p-c-Jun蛋白,与SHAM组比较,SNCI组显著增加（P<0.05）,DEA显著减少（P<0.05）。Cleaved Caspase-3蛋白,与SHAM组比较,SNCI组显著增加（P<0.05）,SEA和DEA显著减少（P<0.05）,两组之间无统计学差异。Cleaved Caspase-8蛋白,SHAM、SNCI、SEA和NEA组表达无统计学差异,DEA组显著降低（P<0.05）。论文三针刺“环跳”穴对坐骨神经损伤模型大鼠雪旺细胞S100蛋白的影响1针刺对大鼠坐骨神经雪旺细胞S100蛋白表达的影响与SHAM组比较,SNCI组S100表达减少（P<0.05）。与SNCI组比较,SEA、DEA组表达升高（P<0.05）,DEA组表达高于SEA组（P<0.05）。二、体外细胞实验论文四针刺血清调控JNK信号通路干预H₂O-₂诱导的RSC96细胞凋亡的实验研究1针刺血清对H₂O-₂诱导的RSC96细胞活力的影响不同浓度H₂O-₂干预细胞6h后,0-50μM组细胞活力随着H₂O-₂浓度的增加而降低;50-200μM组细胞活力未见明显变化;200-800μM组细胞活力随着H₂O-₂浓度的增加而增加。50μM H₂O-₂干预细胞6h后,细胞增殖抑制效率较大,增殖抑制率约为80%,因此选择H₂O-₂终浓度为50μmol/L,干预时间6h作为H₂O-₂诱导RSC96细胞损伤的实验条件。不同浓度针刺血清干预细胞24、48、72h后,细胞活力随着血清浓度的增加而逐渐降低。10%浓度针刺血清孵育RSC96细胞各个时间的细胞活力差异性较小,且对细胞增殖的抑制率较低,分别是16%、22%、14%,因此选择针刺血清浓度为10%作为针刺血清孵育RSC96细胞的实验条件。Control组细胞活力较高,培养24、48、72h后细胞存活率均为90%以上。H₂O-₂组细胞活力较低,培养24、48、72h后细胞存活率分别约为23%、20%、18%。H₂O-₂+Acupuncture serum组细胞活力相差较大,培养24、48、72h后细胞存活率分别约为40%、84%、66%。因此选择针刺血清干预时间为48h作为针刺血清孵育RSC96细胞的实验条件,此时细胞存活率提高最为显著。2针刺血清对H₂O-₂诱导的RSC96细胞周期的影响与Control组细胞（GO/G1期:37.87%;S期:41.13%;G2/M期:13.60%）比较,H₂O-₂组GO/G1期下降为25.50%（P<0.05）,S期上升为50.87%（P<0.05）。与H₂O-₂组细胞比较,H₂O-₂+Acupuncture serum组S期下降为32.33%（P<0.05）,G2/M期上升为18.30%（P<0.05）,说明H₂O-₂使细胞周期被阻滞在S期,针刺血清能有效解除H₂O-₂引起的S期阻滞。3针刺血清对H₂O-₂诱导的RSC96细胞凋亡的影响Control组正常细胞占绝大多数,早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞均较少。与Control组比较,H₂O-₂组早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞均显著增多（P<0.05）。与H₂O-₂组比较,H₂O-₂+Acupuncture serum组早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞均显著减少（P<0.05）,但仍多于Control组（P<0.05）。4针刺血清对RSC96细胞上清液中TNF-α水平的影响Control组TNF-α水平未发生显著改变。H₂O-₂诱导使细胞上清液中TNF-α水平升高（P<0.05）,24h时达到峰值。Acupuncture serum干预下24h时开始下降,36h时水平更低（P<0.05）。5针刺血清干预RSC96细胞JNK信号通路对凋亡的影响5.1免疫荧光法检测针刺血清对RSC96细胞S100、Cleaved caspase-3蛋白表达定位S100蛋白荧光强度各组均较高,组间未见明显差异。Cleaved caspase-3蛋白,Control组和H₂O-₂+Acupuncture serum组荧光强度较低,H₂O-₂组强度较高。5.2 Western Blot法检测针刺血清对RSC96细胞p-JNK、p-c-Jun、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-8、Cleaved Caspase-3蛋白表达的影响p-JNK蛋白,与Control组比较,H₂O-₂组表达显著增加（P<0.05）;加入SP600125后表达减少（P<0.05）。p-c-Jun蛋白,与Control组比较,H₂O-₂组表达显著增加（P<0.05）;加入SP600125后表达减少（P<0.05）。Bcl-2/Bax蛋白比值,与Control组比较,H₂O-₂组显著减少（P<0.05）;与H₂O-₂组比较,H₂O-₂+Acupuncture serum组显著升高（P<0.05）;加入SP600125后显著升高（P<0.05）。Cleaved Caspase-3蛋白,与Control组比较,H₂O-₂组表达显著增加（P<0.05）;与H₂O-₂组比较,H₂O-₂+Acupuncture serum组和H₂O-₂+Acupuncture serum+SP600125组表达减少（P<0.05）。Cleaved Caspase-8蛋白,与Control组比较,H₂O-₂组表达显著增加（P<0.05）;与H₂O-₂组比较,H₂O-₂+Acupuncture serum组表达减少（P<0.05）;加入SP600125后表达减少（P<0.05）。结论:1.浅刺和深刺“环跳”穴能改善神经运动功能、传导功能,加快神经结构恢复,深刺效果优于浅刺。说明针刺具有改善神经运动功能和传导功能,修复组织形态结构的功能;针刺具有提高机体抗氧化能力,减少氧化损伤的功能,且深刺效果更为显著。2.针刺可调节JNK信号通路,抑制c-Jun磷酸化,使Bcl-2/Bax基因和蛋白的比值增高,Caspase-8和Caspase-3基因和活化蛋白表达减少,抑制神经细胞凋亡,深刺效果更佳。说明针刺具有通过调控JNK信号通路抑制神经细胞凋亡的功能。3.坐骨神经损伤局部组织的S100表达减少,针刺使损伤局部组织的S100表达增加。说明针刺具有促进雪旺细胞增殖和成熟的功能。4.针刺血清具有促进氧化损伤的RSC96细胞增殖的功能;针刺血清和JNK抑制剂均能够通过调控JNK信号通路抑制细胞凋亡;针刺血清抑制氧化损伤的RSC96细胞凋亡的机制可能通过调控JNK信号通路实现。