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本课题研究内容包括两部分内容,第一部分为:TTF-1启动子调控miR-7表达对人肺癌裸鼠模型肿瘤生长的影响;第二部分为:TTF-1启动子调控miR-7表达影响人肺癌模型肿瘤生长的分子机制;分述如下:目的:第一部分:常规建立人肺癌裸鼠荷瘤模型,结合HE染色、免疫荧光(Ki-67、TUNEL)、原位杂交、实时荧光定量PCR,观察TTF-1启动子靶向表达miR-7对人肺癌模型肿瘤生长的影响。第二部分:利用肿瘤组织c DNA基因芯片、实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和Western blot等技术,并结合过表达靶分子等初步探讨TTF-1启动子靶向调控miR-7表达对人肺癌体内生长的可能分子机制。方法:第一部分:建立人肺癌裸鼠肿瘤模型。于模型建立后在肿瘤对侧远端皮下分别注射100 mg p-T-miR-7重组质粒和p-Cont质粒(每组各10只),每隔3天注射一次,连续注射5次,并每3天测量一次肿瘤大小。末次注射3天后,麻醉处死模型小鼠。取肿瘤组织和肺组织,HE染色观察其组织形态学变化;免疫荧光技术检测肿瘤组织中增殖核抗原Ki-67蛋白的表达变化;TUNEL法检测肿瘤局部细胞凋亡情况;Real-time PCR和原位杂交检测肿瘤组织中miR-7的表达;此外,利用Real-time PCR检测与肿瘤细胞生长周期相关的蛋白依赖性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表达变化,以及转移相关分子E-cadherin、CXCR4、MMP-2、MMP-3和MMP-9的表达变化。最后,利用Western blot检测相关信号途径,包括Akt/Erk等信号通路的传递改变。第二部分:提取人肺癌95D移植瘤模型中p-Cont组和p-T-miR-7组中肿瘤组织,送c DNA基因芯片检测,筛选出差异表达基因;进一步运用生物信息学技术和Real-time PCR技术筛选miR-7可能作用的靶分子,经筛选选定NDUFA4作为miR-7的候选靶分子,并用Western blot和免疫组化验证其表达;进一步通过分子克隆技术构建过表达靶分子NDUFA4的真核载体(命名为p-NDUFA4);并且将p-NDUFA4体外瞬时转染人肺癌95D细胞,Real-time PCR检测NDUFA4的表达水平;通过CCK-8实验、划痕实验、克隆形成实验检测转染后NDUFA4对人肺癌细胞的增殖、迁移和克隆形成能力的影响;此外,利用Real-time PCR检测肿瘤细胞生长周期相关蛋白依赖性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表达变化,以及转移相关分子E-cadherin、CXCR4、MMP-2、MMP-3和MMP-9的表达变化。最后,利用Western blot技术检测NDUFA4、Akt、Erk、磷酸化Akt和磷酸化Erk的表达水平。为了检测下调NDUFA4的表达是否可以逆转TTF-1启动子调控miR-7表达对人肺癌体内生长的抑制效应,我们将p-T-miR-7和p-NDUFA4体外共转染于人肺癌95D细胞。通过CCK-8实验、划痕实验、克隆形成实验检测共转染后细胞的生长、迁移和克隆形成能力的变化;此外,利用Real-time PCR检测肿瘤细胞中NDUFA4、生长周期相关蛋白依赖性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表达变化,以及转移相关分子E-cadherin、CXCR4、MMP-2、MMP-3和MMP-9的表达变化。最后,利用Western blot技术检测Akt、Erk、磷酸化Akt和磷酸化Erk的表达水平。结果:第一部分:动态观察人肺癌裸鼠模型的肿瘤生长,并统计绘制肿瘤生长曲线。结果显示与p-Cont对照组相比,p-T-miR-7实验组肿瘤生长缓慢(P<0.05);荷瘤裸鼠肺组织HE染色结果显示:p-Cont对照组荷瘤裸鼠肺部可见明显的肿瘤细胞肺转移,p-T-miR-7实验组镜下并未观察到明显的转移灶。肿瘤组织HE染色结果显示:p-Cont组细胞形态不规则,p-T-miR-7实验组则可见大片坏死区;Real-time PCR检测结果显示,p-T-miR-7实验组中miR-7的表达显著的上调(P<0.05);原位杂交结果显示:p-T-miR-7实验组中miR-7的表达显著的上调(P<0.05);免疫荧光法检测显示:与p-Cont对照组相比,p-T-miR-7实验组肿瘤组织细胞Ki-67表达量显著减少(P<0.05);原位凋亡实验(TUNEL法)检测结果显示:与p-Cont对照组相比,p-T-miR-7实验组肿瘤组织局部细胞的凋亡显著增加;Real-time PCR检测结果显示:荷瘤模型肿瘤组织细胞生长周期相关的蛋白依赖性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表达以及转移相关分子E-cadherin、CXCR4、MMP-2、MMP-3和MMP-9的表达均明显下调,且差异具有统计学意义(P<0.05);Western blot结果显示,荷瘤模型肿瘤组织中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表达下调,具有统计学差异(P<0.05);在细胞水平上,Western blot结果也显示,p-T-miR-7转染组细胞中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表达均明显下调,与体内结果一致(P<0.05)。第二部分:肿瘤组织cDNA微阵列芯片分析筛选出大量差异表达的基因。与p-Cont组相比,p-T-miR-7实验组NDUFA4的表达下调4.13倍;Real-time PCR检测结果进一步显示,p-T-miR-7实验组NDUFA4在人肺癌荷瘤肿瘤组织中的表达均较p-Cont对照组显著下调(P<0.05);此外,在细胞水平上,p-T-miR-7转染95D细胞后NDUFA4的表达也显著下调(P<0.05),提示NDUFA4可能是miR-7的靶分子;进一步运用Western blot技术以及免疫组化实验检测发现,与p-Cont对照组相比,肿瘤组织中p-T-miR-7组靶分子NDUFA4蛋白的表达显著下调(P<0.05);成功构建过表达NDUFA4的真核表达载体(pc DNA3.1-NDUFA4,命名为p-NDUFA4),并将该载体体外瞬时转染人肺癌95D细胞;Real-time PCR检测结果显示:与p-Cont组相比,p-NDUFA4转染组NADUFA的表达显著上调表达(P<0.05);CCK-8法检测结果显示:与p-Cont组相比,p-NDUFA4转染组95D细胞的增殖明显增加(P<0.05);Scratch Assay实验和克隆形成实验结果分别显示:与p-Cont组相比,p-NDUFA4转染组95D细胞迁移能力和克隆形成能力均显著增强(P<0.05);与此同时,Real-time PCR检测结果显示:p-NDUFA4转染组95D细胞中细胞生长周期相关的蛋白依赖性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表达以及相关的转移分子E-cadherin、CXCR4、MMP-2、MMP-3和MMP-9的表达均处于明显上调,且差异具有统计学意义(P<0.05);此外,Western blot结果显示,与p-Cont组相比,p-NDUFA4转染组中95D细胞内NDUFA4、磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表达上调,具有统计学差异(P<0.05);最后,为了验证改变NDUFA4的表达是否可以逆转TTF-1启动子调控miR-7的表达对人肺癌的抑制效应,我们将p-NDUFA4真核过表达载体,同p-T-miR-7载体于体外瞬时共转染人肺癌95D细胞来观察其对细胞生长和转移的可能影响。CCK-8法检测结果显示:与p-T-miR-7单独转染组相比,p-T-miR-7+p-NDUFA4共转染组95D细胞的增殖明显增加,且差异具有统计学意义(P<0.05);Scratch Assay实验和克隆形成实验结果分别显示:与p-T-miR-7单独转染组相比,p-T-miR-7+p-NDUFA4共转染组95D细胞的迁移能力和克隆形成能力也显著增强(P<0.05);Real-time PCR检测结果显示:p-T-miR-7+p-NDUFA4共转染组NDUFA4的表达、细胞生长周期相关的蛋白依赖性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表达以及相关的转移分子E-cadherin、CXCR4、MMP-2、MMP-3和MMP-9的表达均处于明显上调,且差异具有统计学意义(P<0.05);最后,Western blot结果显示,与p-T-miR-7单独转染组相比,p-T-miR-7+p-NDUFA4共转染组中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表达均显著上调,且具有统计学差异(P<0.05);结论:第一部分:TTF-1启动子靶向表达miR-7可以显著抑制人肺癌细胞的体内生长,该效应与Akt/Erk信号通路传递变化有关。第二部分:miR-7可靶向调控NDUFA4的表达,并且过表达NDUFA4可逆转TTF-1启动子调控miR-7表达对人肺癌细胞生长与转移的抑制效应。