研究背景肝细胞癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,其发病率居恶性肿瘤的第六位,死亡率居第三位,严重威胁全世界人民的健康。大部分肝癌患者就诊时已属于中晚期阶段,能真正接受手术切除的比例不足20%。射频消融同手术切除、肝移植一样,已经被公认为肝癌的三大根治性治疗手段之一。近年来,射频消融因其具有微创、恢复快、费用低、安全、可靠、可重复操作、住院时间短等优势,在临床上得到了广泛应用。早期肝癌射频消融治疗的5年总体生存率与手术切除大体相当,但术后复发率较高,这也是影响其临床疗效和预后的重要因素。因此,研究自噬在肝癌射频消融术后复发中的作用及其分子机制,对于减少肝癌射频消融术后复发,改善肝癌射频消融治疗的疗效,具有非常重要的临床意义。大量的研究表明,自噬在肿瘤的发生发展过程中扮演着双重角色。一方面,自噬可清除正常细胞内损伤或衰老的蛋白质和细胞器,抑制肿瘤发生。另一方面,自噬可增强肿瘤细胞对恶劣环境应激的耐受性,促进肿瘤存活。越来越多的研究表明,热应激可在肺癌、宫颈癌细胞中激活自噬,促进肿瘤存活。但热应激能否诱导肝癌细胞发生自噬,以及热应激诱导的自噬在肝癌射频消融术后复发中的作用及其分子机制尚不清楚。本研究在明确肝癌射频消融治疗能诱导自噬发生的基础上,揭示自噬标记物LC3可作为评估RFA术后复发的独立危险因素。体外模拟肝癌射频消融过渡区微环境,证实了热应激能诱导肝癌细胞发生自噬。通过一系列的功能实验验证,阐明了热应激可通过激活ATP-AMPK-mTOR信号通路诱导肝癌细胞发生保护性自噬。抑制自噬,可促进肝癌细胞凋亡增加。研究方法(1)收集陆军军医大学西南医院肝胆外科接受手术切除的肝癌患者的组织样本130例。其中,单纯手术切除100例,射频消融术后复发再次手术切除30例。同时收集5例肝移植供体正常肝组织。取一部分组织冻存于-80℃冰箱中,用于提取组织总蛋白和RNA,另一部分组织标本用4%的多聚甲醛固定,石蜡包埋,组织切片用于免疫组化染色分析。Western blot检测LC3在肝癌细胞和肝癌组织中的表达,免疫组化检测LC3在单纯手术切除和射频消融术后复发再次手术切除肝癌组织中的表达部位和表达强度。(2)采用恒温热水浴模型模拟肝癌RFA过渡区微环境,设置不同温度梯度(37、43、45、47℃)、不同处理时间(0、15、30、45、60min)和热应激后不同检测时间点(0、2、4、8、12、24h)提取细胞总蛋白质进行western blot检测,探索自噬标记物LC3-Ⅱ、p62的表达及动态变化规律,筛选出热水浴处理的最佳温度、处理时间和热应激后最佳检测时间点。肝癌细胞转染自噬双标腺病毒后再进行热应激处理,激光共聚焦显微镜下观察自噬小体和自噬溶酶体的亚细胞定位及数目。透射电镜下观察自噬小体和自噬溶酶体的亚细胞定位及数目。(3)应用氯喹联合热应激处理肝癌细胞,western blot检测自噬标记物LC3-Ⅱ、p62蛋白表达水平的改变,激光共聚焦显微镜下观察自噬小体和自噬溶酶体的亚细胞定位及数目,明确热应激是诱导自噬的发生还是抑制自噬的降解,验证热应激诱导的自噬流是否通畅。(4)应用氯喹联合热应激处理肝癌细胞,CCK-8检测细胞活力的改变,EdU检测细胞增殖活性的改变,流式细胞术检测细胞凋亡率的改变,western blot检测自噬标记物LC3-II、p62及凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3、cleaved RAPR表达水平的改变。siRNA干扰自噬相关基因Beclin-1、Atg5后,western blot检测Beclin-1、Atg5表达的改变,验证siRNA的干扰效率。siRNA干扰自噬相关基因Beclin-1、Atg5后联合热应激处理肝癌细胞,流式细胞术检测细胞凋亡率的改变。(5)采用恒温热水浴模拟肝癌RFA过渡区微环境,热应激处理肝癌细胞,ATPlite试剂盒检测ATP浓度的改变,western blot检测AMPK/mTOR信号通路中p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、p-P70S6K/P70S6K、p-4EBP-1/4EBP-1的表达的改变。应用AMPK激活剂AICAR和抑制剂compound C处理肝癌细胞后,western blot检测p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、LC3-II、p62表达的改变。(6)热应激处理肝癌细胞,将处理后的肝癌细胞种植到裸鼠右上肢近腋窝处皮下。将裸鼠随机分成4组:PBS组,CQ组,热应激组和氯喹联合热应激组,每组6只。对照组腹腔注射100μl PBS,实验组按60mg/kg的剂量腹腔注射氯喹PBS溶液100μl,每周3次。每3天记录肿瘤的体积和质量,直到第30天处死裸鼠。解剖并取下皮下肿瘤,记录肿瘤的体积和质量,用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,组织切片用于H&E染色确认肿瘤组织,免疫组化检测LC3、p62、Ki-67、cleaved Caspase-3的亚细胞定位及表达水平。(7)统计学分析方法:所有研究结果均用均数±标准误表示。采用SPSS18.0软件对数据结果进行统计分析和作图。对于呈正态分布的计量资料,两个组之间的差异比较选用Student’s t检验,而多个组之间的差异比较选择单因素方差分析。对于计数资料,选择卡方检验或Fisher确切概率法进行分析。当P<0.05时,认为差异有统计学意义。研究结果(1)LC3在肝癌细胞株中表达水平明显高于正常肝细胞L02,LC3在肝癌组织中呈现明显高表达的特点,过表达率为77.3%(17/22)。免疫组化显示LC3在射频消融术后复发再切除肝癌组织中表达明显高于单纯手术切除的肝癌组织,而p62在射频消融术后复发再切除肝癌组织中表达明显低于单纯手术切除的肝癌组织,且主要位于细胞浆。临床病理参数的相关性分析表明LC3高表达与术后复发密切相关(P<0.05),而与年龄、性别、HBV感染、Child-Pugh肝功能分级、肝硬化情况、血清AFP水平、肿瘤数目、肿瘤大小、血管侵犯、淋巴结侵犯、肿瘤的分化程度等病理参数无明显相关性。Kaplan-Meier’s分析表明LC3过表达患者较LC3低表达患者5年总体生存期较短,RFA术后复发率较高(P<0.05)。以上结果说明,自噬标记物LC3可作为预测肝癌射频消融术后复发和预后的分子标记物。(2)肝癌细胞SMMC7721和Huh7接受不同温度(37、43、45、47℃)热应激处理1h。随着温度不断升高,LC3-Ⅱ表达增加,而p62表达逐渐减少,说明不同温度的热应激可诱导肝癌细胞发生自噬,且呈现温度依赖性的特点。肝癌细胞SMMC7721和Huh7接受47℃热应激处理不同时间(0、15、30、45、60min)。随着处理时间延长,LC3-Ⅱ表达不断增加,而p62表达逐渐减少,说明热应激处理不同时间均可诱导自噬的发生,且呈现出时间依赖性的特点。肝癌细胞SMMC7721和Huh7转染自噬双标腺病毒HBAD-mRFP-GFP-LC3B后再进行不同温度的热应激处理。激光共聚焦结果显示,绿色斑点的自噬小体和黄色斑点的自噬溶酶体大多位于细胞核周围的细胞浆中,绿色斑点(GFP-LC3)和黄色斑点(mRFP-GFP-LC3)数目均随着温度升高而增加,直观地说明热应激能诱导肝癌细胞发生自噬,呈现温度依赖性的特点。光学显微镜结果表明,热应激处理肝癌细胞SMMC7721和Huh7后出现大量囊状空泡样结构。透射电镜结果证实,热应激处理的肝癌细胞SMMC7721和Huh7中大量增加的囊状空泡样结构为双层膜包裹的自噬小体或自噬溶酶体,平均数目从3增加到20以上(P<0.001)。以上结果表明,亚致死性热应激可诱导肝癌细胞发生自噬,且具有一定的温度依赖性和时间依赖性。47℃热应激处理30min,肝癌细胞SMMC7721和Huh7后,LC3-Ⅱ增加和p62减少均非常显著,且细胞仍保持一定的活力。因此,我们选择47℃热应激处理30min模拟肝癌射频消融过渡区微环境的条件用于开展后续的实验。(3)47℃热应激处理肝癌细胞时间从30min增加至60min时,肝癌细胞SMMC7721和Huh7中LC3-Ⅱ表达进一步增加,而p62表达进一步减少(P<0.001)。47℃热应激30min联合氯喹处理组和47℃热应激30min处理组比较,肝癌细胞SMMC7721和Huh7中LC3-Ⅱ表达进一步增加,而p62表达也进一步增加(P<0.001)。肝癌细胞SMMC7721和Huh7转染自噬双标腺病毒HBAD-mRFP-GFP-LC3B后再进行热应激和氯喹处理,激光共聚焦显微镜下观察并统计分析发现,合并后的荧光图像显示绿色斑点(自噬小体)明显增加,而黄色斑点(自噬溶酶体)增加较少。以上结果表明,亚致死性热应激诱导肝癌细胞内LC3-Ⅱ的蓄积是由于热应激诱导自噬发生引起,而不是抑制自噬的降解过程所致。热应激诱导肝癌细胞发生自噬过程中自噬流是畅通的。(4)氯喹联合热应激处理肝癌细胞SMMC7721和Huh7,CCK-8检测细胞活力结果表明,47℃热应激处理30min可使肝癌细胞SMMC7721和Huh7的活力明显下降,而应用氯喹联合热应激处理,肝癌细胞SMMC7721和Huh7的活力进一步下降,且SMMC7721细胞的活力下降更为明显,差异具有显著统计学差异(P<0.001)。EdU检测细胞的增殖活性结果表明,47℃热应激处理30min可使肝癌细胞SMMC7721和Huh7的增殖活性明显降低,细胞在热应激后增殖几乎停滞。氯喹联合热应激处理,肝癌细胞SMMC7721和Huh7的增殖活性没有进一步地降低。结果表明,氯喹可抑制热应激诱导的自噬,但对细胞增殖活性无明显的影响。流式细胞检测结果表明,47℃热应激处理30min可诱导肝癌SMMC7721和Huh7凋亡增加,用氯喹联合热应激处理肝癌细胞,可使肝癌细胞SMMC7721和Huh7的凋亡率进一步显著增加(P<0.001)。Western blot检测结果表明,47℃热应激处理30min可诱导肝癌SMMC7721和Huh7自噬标记物LC3-II表达增加,p62表达减少,促进凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3、cleaved RAPR表达明显增加。氯喹联合热应激处理肝癌细胞SMMC7721和Huh7,自噬标记物LC3-II表达进一步增加,p62表达也增加,而凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3、cleaved RAPR表达进一步显著增加。此外,用siRNA干扰实验结果表明,siRNA抑制自噬后,热应激诱导的细胞凋亡率明显增加。以上结果均表明,用氯喹或siRNA干扰Beclin-1、Atg5的表达可抑制热应激诱导肝癌细胞发生的自噬,可使热应激抑制的细胞活力明显降低,主要是通过抑制自噬促进热应激诱导的细胞凋亡增加引起,而对热应激抑制的细胞增殖活性无明显影响。(5)47℃热应激处理肝癌细胞30min,ATPlite检测肝癌细胞SMMC7721和Huh7内ATP浓度时发现,热应激处理使肝癌细胞SMMC7721和Huh7内ATP浓度显著降低,差异具有显著统计学意义(P<0.001)。Western blot检测AMPK/mTOR信号通路中相关蛋白表达表明,p-AMPK表达明显增加,p-mTOR表达明显减少。检测mTOR信号通路下游两个关键蛋白p-P70S6K和p-4E-BP1发现,p-P70S6K表达明显减少,p-4E-BP1表达明显也减少。应用AMPK激活剂阿卡地新AICAR处理肝癌细胞作为阳性对照,western blot结果表明,热应激同AMPK激活剂阿卡地新AICAR一样,促进肝癌细胞SMMC7721和Huh7内p-AMPK表达明显增加,p-mTOR表达明显减少,同时促进自噬标记物LC3-Ⅱ表达增加,p62表达减少。而应用AMPK抑制剂compound C联合热应激处理肝癌细胞后,western blot结果表明p-AMPK表达减少,p-mTOR表达增加,自噬标记物LC3-II表达减少,p62表达增加。以上结果表明,热应激诱导肝癌细胞发生自噬是通过激活ATP-AMPK-mTOR信号通路发挥作用的。(6)裸鼠皮下成瘤实验表明,单纯氯喹处理组和PBS组比较,皮下肿瘤的体积和质量无明显差异。热应激处理组与PBS组比较,皮下肿瘤的生长受到了中等程度的抑制,肿瘤的体积和质量明显减少(P<0.001)。与热应激处理组比较,氯喹联合热应激处理组肿瘤的生长受到了明显的抑制,肿瘤的体积和质量进一步明显减少(P<0.001)。取皮下肿瘤组织,经过脱水、固定和石蜡包埋后进行免疫组织化学分析,H&E染色结果表明,肿瘤的异型性明显,核分裂相增多,核质比明显增加,细胞排列紊乱,呈现典型的肝细胞癌的病理学特点。免疫组化结果表明,热应激处理组LC3表达明显增加,p62表达明显减少,主要分布于细胞浆,说明热应激后肿瘤体内也能激活自噬和自噬流。热应激处理组Ki-67表达明显减少,而cleaved Caspase-3表达明显增加,说明热应激可明显抑制肿瘤的增殖活性,促进肿瘤凋亡明显增加。氯喹联合热应激处理肝癌与单纯热应激处理组比较,LC3表达明显增加,而p62表达也增加,Ki-67表达减少,cleaved Caspase-3表达明显增加(P<0.001),说明氯喹可在体内抑制热应激诱导的自噬,促进肿瘤凋亡增加。以上结果表明,氯喹可通过抑制自噬的降解过程抑制热应激诱导的自噬,促进肿瘤细胞凋亡明显增加,可在体内增强射频消融等热疗的抗肿瘤效应。研究结论综上所述,自噬标记物LC3在肝癌细胞和肝癌组织中高表达,尤其是射频消融术后复发的肝癌组织中的表达更高。LC3高表达与肝癌射频消融术后复发率呈明显正相关,表明LC3可作为判断肝癌射频消融术后复发和预后的分子靶标。此外,体外模拟肝癌射频性消融过渡区微环境发现,不同温度热应激处理不同时间均可诱导肝癌细胞发生自噬,且具有一定的温度和时间依赖性。氯喹联合热应激处理肝癌细胞证实热应激诱导的肝癌细胞内LC3-Ⅱ的蓄积是由热应激诱导自噬的发生引起,而不是抑制自噬的降解所致。热应激诱导肝癌细胞发生自噬过程中自噬流是畅通的。功能实验研究表明,热应激诱导肝癌细胞发生的自噬对肝癌细胞是保护性的,氯喹或siRNA干扰自噬相关基因Beclin-1、Atg5可抑制热应激诱导的自噬,促进热应激诱导的肝癌细胞凋亡明显增加。体内实验证实,氯喹联合热应激处理肝癌细胞,可抑制热应激诱导的自噬,明显抑制皮下肿瘤的生长,使皮下肿瘤的体积和质量明显减少,促进肿瘤细胞凋亡增加,增强肿瘤热疗的抗肿瘤效应。进一步的分子机制研究表明,热应激诱导肝癌细胞发生自噬主要是通过激活ATP-AMPK-mTOR信号通路发挥作用的。通过该研究,阐明了自噬在肝癌射频消融术后复发中的作用及其分子机制,为减少肝癌RFA术后复发,改善肝癌RFA治疗疗效提供了新的思路和治疗策略。