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生物化学发光技术在生物检测和临床诊断等方面有广阔的应用前景。然而,生物化学发光强度弱,衰变时间相对较长,制约了该技术的实际应用。所以,迫切需要开发能增强生物化学发光强度、提高其反应速率的新方法。
已有研究发现,光子能够与贵金属纳米粒子表面上的等离激元产生强耦合作用,并能产生102-103倍的近场荧光增强和化学发光增强。这种近场增强效应的产生存在临界距离,即仅当发光簇和金属纳米粒子表面之间的距离在10-20纳米范围内,才能观察到近场表面增强效应;如果距离过小,所发射的荧光易被金属纳米粒子猝灭;距离如果过大,所发出的光子不易与金属纳米粒子产生耦合作用。本论文拟采用可控壁厚的聚合物壳层来保证金纳米粒子的近场增强效应,增强生物化学发光蛋白的生物化学发光特性;进一步地,为了实现在肿瘤细胞内生物化学发光,通过制备一个合适的蛋白传递载体,将生物发光蛋白传递到肿瘤细胞内实现肿瘤细胞的显影。
论文设计并建立两种聚合物体系作为纳米级蛋白载体,它们分别是:基于自组装的蛋白纳米胶囊和基于自由基聚合的蛋白纳米胶囊;考察了上述两种蛋白载体的结构、功能和细胞毒性,选择基于自由基聚合的蛋白纳米胶囊用于实现基于金纳米粒子表面增强化学发光的肿瘤显影。
论文的主要研究内容和研究发现如下:
1、设计并制备了基于自组装的蛋白纳米胶囊。利用自组装方法,通过自交联和添加小分子交联剂实现交联,在微流体芯片上合成10纳米左右大小的均匀单核蛋白纳米胶囊,通过该蛋白传递系统成功地将多种蛋白传递到肿瘤细胞内。该方法很好地保存了被包裹蛋白的活性,提高了蛋白纳米胶囊的抗蛋白酶能力,具有合成快速便捷、成本低等优点。
2、制备了基于自由基聚合的蛋白纳米胶囊,即通过共价的方式结合在蛋白表面制备蛋白纳米胶囊。首先在蛋白表面修饰一定量的双键,而后浸入含有不同浓度比的单体、交联剂和引发剂的溶液中,在蛋白表面形成了一层聚合物层,通过调控所加入的单体或交联剂的浓度,可得到10-30纳米左右、带不同表面电荷的、有不同功能的蛋白纳米胶囊;成功地利用该蛋白纳米胶囊技术将蛋白质传递至细胞内。该胶囊保护蛋白具有高的稳定性,具有抗蛋白酶和抗高温的特性。
3、用次氯酸钠-过氧化氢-发光胺系统分别验证银纳米粒子、金纳米球和金纳米棒的化学发光增强效应;通过比较其毒性、细胞内吞效率和增强效率,选择金纳米球作为用于生物发光增强的纳米粒子;通过比较两种蛋白传递载体的结构、功能、细胞毒性等参数,选择基于自由基聚合的蛋白纳米胶囊作为后续研究所用载体;以辣根过氧化酶作为模型生物发光酶,将其包裹在基于蛋白表面自由基聚合的纳米胶囊中,再结合一定量的金纳米粒子,用透射电镜和紫外可见光吸收谱表征了其结构;研究表明,该辣根过氧化酶-纳米胶囊体系结构稳定,能够实现生物化学发光的增强,增强倍数近10倍,衰变速率提高了2.4倍;并且该胶囊能够被成功地传递至肿瘤细胞内,实现了肿瘤细胞显影。