我国是一个赤潮多发国家,赤潮的爆发不仅会对海洋生态环境造成破坏,还会危害水产品安全,甚至威胁到人类的健康。因此,有必要建立一种有效的方法对赤潮藻尤其是产毒藻类进行实时监控。传统的藻类检测方法具有一定的局限性,而且以往建立的技术只能对单种赤潮藻进行检测,实用性较差。因此,本研究建立了一种产毒藻类的高通量检测新方法—滚环扩增(rolling cycle amplification,RCA)-膜分类芯片检测技术。本研究选取了8种海洋常见产毒微藻,包括包括海洋卡盾藻(Chattonella marina,Cm)、赤潮异湾藻(Heterosigma akashiwo,Ha)、米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi,Km)、强壮前沟藻(Amphidinium carterae,Ac)、剧毒卡尔藻(Karlodinium veneficum,Kv)、利玛原甲藻(Prorocentrum lima,Pl)、塔玛亚历山大藻(Alexandrlum tamarense,At)和链状亚历山大藻(A.catenella,Aa)作为测试对象,通过基因克隆对其进行分子鉴定。首先,提取目标藻的基因组DNA,对其核糖体大亚基(ribosomal large subunit,LSU)D1-D2区进行PCR扩增,扩增产物纯化回收后与载体连接,并导入到大肠杆菌中进行克隆,获得的阳性克隆菌株用于商业测序,将测序结果进行BLASTn比对分析,确认藻种的正确性。进一步根据各目标藻种的测序结果,下载亲缘关系较近或序列相似性较大物种的核酸序列,将其与目标藻种的LSU序列进行比对分析,获取种特异性序列,并以此为基础,根据探针设计原则设计各目标藻的特异性锁式探针(padlock probe,PLP)、通用引物P1和P2及分类探针cZip。以海洋卡盾藻为研究对象,建立了该藻的RCA与试纸法检测技术。对RCA检测参数进行了优化,包括PLP连接时间和连接温度、RCA扩增时间和扩增温度,优化结果为:连接时间60 min,连接温度65°C,扩增时间60 min以及扩增温度61°C。对海洋卡盾藻PLP以及分类探针cZip进行了特异性验证,对RCA技术以及试纸法检测技术进行了灵敏度测试,并最终通过模拟自然水样对RCA与试纸法检测技术进行了实用性验证。结果表明,本研究设计的海洋卡盾藻PLP及分类探针特异性较好,RCA与试纸法对海洋卡盾藻质粒的检测极限分别为10copies/μL和1 copies/μL,并分别比PCR技术高2和3个数量级;PCR、RCA和试纸法对模拟自然水样的检测极限分别为103 cells、1 cell和0.1 cell,同样显示试纸法比RCA和PCR技术具有更高的检测灵敏度。建立8种目标藻的RCA-膜分类芯片检测技术,建立流程为:膜芯片的制备→探针点样→RCA扩增和标记→核酸杂交→洗膜→抗体反应→洗膜→显色。首先选取24种测试藻种,对PLP和分类探针进行特异性验证,其中分类探针的特异性验证采用斑点杂交法,结果表明PLP和分类探针特异性较好;其次,对RCA-膜分类芯片检测技术的各条件进行了优化,包括PLP连接时间和温度、RCA扩增时间、RCA扩增温度、探针的紫外交联时间、探针上样量、RCA产物浓度、杂交时间及温度和洗膜温度,优化结果如下:PLP连接温度61°C,PLP连接时间70 min,RCA扩增温度64°C,RCA扩增时间50 min,紫外交联时间1 min,探针上样量10 ng,RCA产物浓度250 ng,杂交时间2 h,杂交温度44°C和洗膜温度50°C。为与当前常用的PCR标记膜分类芯片的检测灵敏度进行比较,根据8种产毒微藻的LSU序列,设计分类探针,建立了目标藻的PCR-膜分类芯片检测技术。用不同浓度的含目标藻LSU序列的质粒作为模板制备生物素标记PCR和RCA产物,并测试RCA-膜分类芯片和PCR-膜分类芯片的检测灵敏度,结果表明,PCR-膜分类芯片检测技术和RCA-膜分类芯片检测技术所能检测的质粒浓度极限分别是100 copies/μL和10 copies/μL,RCA-膜芯片检测技术比PCR-膜芯片检测技术的灵敏度高1个数量级。最后,以模拟自然水样为测试对象,对RCA-膜分类芯片检测技术进行实用性验证,并与PCR-膜分类芯片检测技术进行比较,结果表明:RCA和PCR-膜分类芯片检测技术均能对模拟自然样品中的目标藻进行有效检测,验证了本研究建立的检测技术的实用性,灵敏度测试显示,RCA-膜分类芯片检测技术所能检测的模拟自然水样中的藻细胞数是0.1 cell,比PCR-膜芯片在检测藻细胞数方面灵敏度高1个数量级。