近年来的研究提示在急性肺损伤(ALI)的早期,肺成纤维细胞即可能被活化,产生胶原蛋白从而启动了肺纤维化的进程,但其活化及作用机制尚不明确。　　 感染是引起急性肺损伤的重要因素,革兰氏阴性杆菌细胞壁的脂多糖(LPS)是内毒素的主要成份,通过作用于靶细胞的Toll样受体4(TLR4)产生生物学效应；有研究表明肺成纤维细胞存在TLR4的表达,提示LPS可能通过TLR4对肺成纤维细胞具有直接作用而参与肺纤维化的进程。　　 磷脂酰肌醇3激酶-Akt(PI3K-Akt)信号通路参与了肺巨噬细胞中由LPS诱发的,经TLR4所介导的急性炎性反应。该通路同样存在于肺成纤维细胞中并与该细胞的活化与胶原分泌密切相关。　　 因此,目前有理由推测:在LPS诱导的急性肺损伤过程中,LPS可能通过TLR4直接作用于肺成纤维细胞,而PI3K-Akt通路也可能参与TLR4介导的信号传导途径并直接引起肺成纤维细胞的活化和胶原分泌。　　 本课题运用基于慢病毒转染的RNAi技术抑制小鼠TLR4基因的表达,分别从细胞和组织水平而全面研究肺成纤维细胞TLR4在LPS诱导的急性肺损伤肺纤维化过程中的作用,为该病的有效防治提供理论依据。本课题研究共分以下三部分:　　 第一部分小鼠肺成纤维细胞TLR4 siRNA序列的设计和siRNA慢病毒载体的构建　　 目的:设计、构建和鉴定TLR4-RNAi慢病毒载体(Lentivirus-TLR4-siRNA)用于后续实验。　　 方法：设计、制备3个针对TLR4基因的siRNA质粒并进行慢病毒包装。转染原代培养的小鼠肺成纤维细胞后通过Real-timePCR筛选RNA干扰最佳靶点。　　 结果：经PCR鉴定和测序验证,成功构建了3个针对的TLR4基因的siRNA质粒并进行慢病毒包装,形成TLR4-RNAi慢病毒载体(Lentivirus-TLR4-siRNA)；经Real-time PCR筛选出最佳TLR4-RNAi慢病毒载体(Target2＃),其病毒滴度测定结果为8×107TU/ml,抑制效率约80％。　　 结论：针对TLR4基因的Lentivirus-TLR4-siRNA能有效抑制原代培养的小鼠肺成纤维细胞TLR4基因的表达,用于后续实验。　　 第二部分 TLR4 siRNA对LPS刺激的小鼠肺成纤维细胞信号传导通路的影响　　 目的:明确LPS是否对肺成纤维细胞的活化具有直接作用并进一步研究其作用机制。　　 方法：通过ELISA、real-time PCR和Western-blot检测肺成纤维细胞经转染Lentivirus-TLR4-siRNA抑制TLR4基因表达或使用PI3K抑制剂LY294002阻断PI3K-Akt通路后,细胞经LPS刺激后细胞活化,胶原分泌、TLR4、整合素β1的表达量以及PI3K-Akt通路的活化情况。　　 结果：经LPS刺激72小时后的小鼠肺成纤维细胞TLR4,Ⅰ型前胶原蛋白,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及磷酸化Akt(p-Akt)表达增加,细胞培养上清液中PICP含量同时增加。Toll样受体4被LPS活化后可以同时上调整合素β1以及Toll样受体4自身的表达。以上所有变化均可在细胞被转染Lentivirus-TLR4-siRNA或经LY294002处理后抑制。　　 结论：LPS能够通过TLR4激活PI3K-Akt通路,直接刺激肺成纤维细胞活化和胶原蛋白分泌；并可以通过上调整合素β1以及TLR4自身的表达而加速急性肺损伤和肺纤维化的进程。　　 第三部分体内转染TLR4 siRNA对LPS诱导的急性肺损伤小鼠肺纤维化的影响　　 目的:评价体内转染Lentivirus-TLR4-siRNA抑制TLR4基因表达的方法在延缓LPS所诱导的急性肺损伤肺纤维化病理过程中的作用。　　 方法：建立尾静脉注射Lentivirus-TLR4-siRNA的体内转染途径并使用小剂量LPS连续腹腔注射制作LPS诱导的小鼠ALI肺纤维化动物模型。通过病理学评分、ELISA、肺组织羟脯氨酸含量测定以及real-time PCR或Western-blot等技术比较小鼠经体内转染Lentivirus-TLR4-siRNA抑制肺组织TLR4基因表达后其在LPS刺激后不同时期肺组织纤维化程度、肺成纤维细胞活化、胶原合成和分泌情况、TLR4和整合素β1表达强度以及PI3K-Akt通路的活化情况。　　 结果：小鼠在LPS刺激后72小时,肺组织即出现明显的炎性反应,BALF中PICP含量明显升高,Ⅰ型前胶原蛋白、α-SMA、TLR4和整合素β1 mRNA水平以及Akt磷酸化水平上调；在28天出现典型的间质纤维化表现,肺组织羟脯氨酸含量显著增高,以上各指标表达强度进一步加强。转染TLR4-siRNA lemivirus可以显著抑制以上变化。　　 结论：抑制肺组织TLR4的表达有助于延缓LPS所诱导的急性肺损伤肺纤维化病理发展过程。　　 总结　　 在内毒素引起的急性肺损伤过程中,LPS通过TLR4激活PI3K-Akt通路而直接引起肺成纤维细胞的活化以及胶原的合成和分泌,通过上调整合素β1以及TLR4自身的表达而加速急性肺损伤和肺纤维化的进程。抑制肺组织TLR4的表达有助于延缓LPS所诱导的急性肺损伤肺纤维化的病理过程。