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由水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)引起的水稻条纹叶枯病给我国的水稻生产造成了巨大损失。该病毒由介体灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen)传播,能够在介体内循回增殖且经卵传播给后代。目前,病毒如何适应介体灰飞虱的抗病毒免疫反应机制尚不清楚。有研究发现NS3是RSV的基因沉默抑制子,很可能在RSV侵染灰飞虱的过程中起到重要的作用。本文以RSV-NS3作为诱饵蛋白筛选灰飞虱酵母双杂交cDNA文库,筛选到一系列灰飞虱体内与NS3互作的蛋白因子,并且对一个关键因子RNaseⅢ (Dicer-2的一个功能域)与NS3蛋白之间的相互进行了进一步分析。1、利用酵母双杂交系统筛选灰飞虱体内与RSV-NS3互作蛋白因子构建诱饵蛋白酵母双杂交载体pGBKT7-NS3,并将其转入酵母菌AH109中,利用酵母双杂交系统筛选灰飞虱cDNA文库,PCR筛选出插入片段大于500 bp的酵母质粒转化大肠杆菌,测序分析。在Genbank数据库中Blast比对后,确定插入片段的基因属性,最后获得10个不同的基因,分别是卵黄原蛋白、含C2结构域蛋白、RNaseⅢ domain、MD-2相关脂质识别蛋白样亚型1、DUF1639超家族蛋白、DUF4497超家族蛋白、TweedleE (DUF243超家族蛋白)、热激蛋白70、类Icarapin蛋白、含BTB/POZ结构域蛋白2。2、灰飞虱RNaseⅢ与RSV-NS3互作验证根据文库筛选结果,我们主要针对RNaseⅢ (Dicer-2蛋白的一个功能域)做了重点研究。分析Dicer-2蛋白功能结构,确定其RNaseⅢ功能域,并克隆其基因,利用酵母双杂交实验进一步验证了RNaseⅢ与NS3蛋白的互作关系。3、RNaseⅢ的切割活性分析构建RNaseⅢ的原核表达载体,在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行了原核表达,经纯化获得了纯化的RNaseⅢ蛋白。纯化的RNaseⅢ与dsGFP孵育进行切割活性分析,结果显示：纯化的RNaseⅢ具有切割dsRNA的活性。采用二倍稀释法逐级稀释RNaseⅢ蛋白后进行切割活性分析,确定了RNaseⅢ的有效浓度为6 ng/μL。延长反应时间进行切割活性分析,结果显示：反应时间延长有助于RNaseⅢ蛋白切割功能的增强。4、NS3蛋白对RNaseⅢ切割活性的影响在大肠杆菌BL21 (DE3)中原核表达NS3蛋白,经纯化获得了纯化的NS3蛋白。在RNaseⅢ切割dsRNA体系中加入纯化的NS3蛋白孵育,发现NS3促进了RNaseⅢ对dsRNA切割。同时,初步建立了可介导RNA沉默(RNAi)的灰飞虱胚胎提取物(Embryo Lysate)体系,该体系中灰飞虱体内的Dicer-2蛋白RNaseⅢ功能域也具有切割dsRNA的活性。在Embryo Lysate体系中加入NS3与dsRNA孵育,结果显示NS3同样促进了RNaseⅢ功能域对dsRNA的切割。之前研究报道NS3不能结合dsRNA,但可以结合siRNA,以抑制沉默复合体RISC的组装,从而抑制寄主的RNAi抗病毒反应。本研究表明：NS3可促进Dicer-2蛋白RNaseⅢ功能域切割dsRNA变为自己的结合靶标siRNA,从而有利于其抑制沉默功能的行使。