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目的:探讨低氧状态下水通道蛋白1(Aquaporin1,AQP1)是否参与活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的转运。探讨化学性低氧刺激下AQP1是否存在谷胱甘肽化修饰以及AQP1与ROS之间的关系。 方法:⑴构建AQP1过表达细胞株:通过慢病毒感染人脐静脉内皮细胞(HumanUmbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC),转入带有AQP1的基因序列的质粒,建立稳定过表达AQP1的细胞株。⑵细胞低氧:AQP1过表达细胞与HUVEC正常细胞在96孔板中进行培养,待细胞80%-90%融合后更换培养基,在三气孵育箱(设置参数为:1%O2、5%CO2、94%N2)中分别按0、2、4、6小时进行低氧处理。⑶活性氧检测:低氧处理后细胞使用DCFH-DA探针孵育30min,洗去未进入细胞的DCFH,通过酶标仪在激发波长485nm,发射波长525nm条件下检测各组细胞的OD值。⑷30μM碘乙酰胺处理Balb/3T3成纤维细胞4小时。⑸免疫沉淀:裂解细胞后提取细胞内蛋白,通过蛋白A—琼脂糖珠连接抗体—抗原,纯化细胞内AQP1。⑹western blot:使用抗谷胱甘肽抗体或AQP1抗体检测免疫沉淀得到的蛋白样品。 结果:①在荧光显微镜下观察慢病毒感染细胞的结果,与AQP1基因结合的GFP在细胞内呈绿色荧光,如图中所示,其余未转入AQP1基因序列的在图中呈黑色区域,图中大部分细胞发出绿色荧光,表明AQP1的基因序列成功导入宿主细胞。②无论是在生理状态还是低氧刺激下,AQP1过表达HUVEC与正常HUVEC其内活性氧浓度存在差异,2小时处我们发现AQP1过表达组细胞较HUVEC正常细胞ROS浓度低,但结果不具有统计学差异(P2=0.306)。而6小时处两组细胞间结果没有差异(P6=0.664)。③通过非还原SDS-PAGE于35Kd处沉淀所得AQP1,在同一位置处出现GSH条带,且与阴性对照有明显差别。 结论:水通道蛋白1无论是在生理状态下还是细胞处于氧化应激时,其都能参与细胞内活性氧的转运,维持细胞内氧化应激水平。AQP1存在谷胱甘肽化修饰。