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背景肺癌是世界最常见的癌症之一,在癌症引起的死亡中占主要部分。肺癌主要分型有两种,即小细胞肺癌(SCLC)与非小细胞肺癌(NSCLC),其中NSCLC占80%-85%。肺癌常见的传统治疗方法有很多,例如外科切除、化疗、放疗或者综合治疗。对于非小细胞肺癌,即使经过这些传统方法治疗仍有70%患者因原位浸润或远处转移致5年生存率低于16%。因此了解肺癌的发生发展的分子机制对NSCLC的诊断与治疗十分必要。MicroRNA是由包含21个碱基的非编码RNA组成的庞大家族。它们的主要作用是参与基因的翻译后修饰与调控。miRNA可以调节细胞的生物功能其中包括增殖和生长分化等重要细胞活动。这在癌细胞中有着重要意义。有研究已经表明miR-148a-3p表达量在胃癌,喉癌以及膀胱癌中明显降低,并且过表达miR-148a-3p可以抑制LSCC与BC的增殖与分化。本研究为明确miR-148a-3p在非小细胞肺癌中的表达,功能和分子机制。Son of sevenless(SOS)是Ras特异的鸟苷酸交换因子,其与Ras上的受体酪氨酸激酶(RTK)偶联可以激活Ras,即促进失活态Ras-GDP向有活性的Ras-GTP转变。在人体中SOS家族包括两种同分异构体,SOS1和SOS2,其中SOS2可以促进Ras的活化过程。Ras激活后可以进一步与效应蛋白相互作用,例如可以激活MAPK/ERK通路的Raf和PI-3激酶。很多研究表明,在细胞周期,迁移侵袭,细胞形态维持以及细胞增殖分化过程中信号的瀑布式级联放大效应起着重要作用。然而,SOS2在NSCLC细胞中的作用及其与下游信号分子的作用仍是未知。目的在NSCLC细胞系中使用qRT-PCR检测miR-148a-3p表达水平,通过功能试验实验证实miR-148a-3p在非小细胞肺癌细胞系HCC827与A549中的生物学作用,分析其影响NSCLC细胞的表观遗传学机制。仪生物信息学分析为基础、预测miR-148a-3p潜在调控靶点,通过对靶基因SOS2的沉默表达实验,验证miR-148a-3p对靶点调控的意义,进一步探索SOS2在调控中的分子机制。方法1.在四种非小细胞癌细胞系(A549,H1299,H1975和HCC827)与胎肺成纤维细胞MRC-5中检测miR-148a-3p相对表达量。2.通过对HCC827与A549细胞转染miR-148a-3p mimic使细胞过表达miR-148a-3p,进一步进行获得性功能试验。通过CCK8,流式细胞周期检测和克隆形成试验分析细胞增殖改变。通过划痕实验和小室侵袭迁移实验分析miR-148a-3p过表达对细胞迁移侵袭的影响。3.利用在线生物信息学工具可以预测并筛选miR-148a-3p靶基因,通过Westem Blot,荧光定量PCR等检测方法验证在非小细胞肺癌细胞系中miR-148a-3p预测结合靶基因的mRNA及蛋白水平的相应变化。通过构建荧光素双报告质粒验证miR-148a-3p所做用的靶基因3’-UTR区结合位点,通过siRNA干扰靶基因表达和拯救实验证实miR-148a-3p与靶基因存在靶向调控作用。结果1.MiR-148a-3p在非小细胞肺癌细胞系中表达量显著降低。2.细胞系HCC827与A549中过表达miR-148a-3p可通过G1期阻滞抑制癌细胞增殖,并且其可抑制以上细胞系克隆形成能力。Transwell小室实验和划痕实验验证miR-148a-3p可降低非小细胞肺癌的侵袭迁移能力。3.通过在线生物信息学分析,miR-148a-3p的潜在靶基因之一为SOS2。我们通过western blot和定量PCR实验验证,过表达miR-148a-3p后,SOS2在mRNA以及蛋白水平均有降低。进一步荧光素酶双报告实验证实,miR-148a-3p可直接作用于SOS2的3’-UTR区,即SOS2为miR-148a-3p的直接作用靶点。4.经细胞信号通路分析,我们发现在过表达miR-148a-3p与干扰SOS2表达之后,MAPK/ERK通路的关键蛋白与增殖、侵袭迁移相关的转录因子在蛋白水平均有相应下调,证明miR-148a-3p靶向SOS2抑制非小细胞肺癌增殖、侵袭迁移能力的分子机制是通过MAPK/ERK信号通路实现的。结论1.与MRC-5相比,非小细胞肺癌细胞系中miR-148a-3p表达量明显较低,且miR-148a-3p与非小细胞肺癌的增殖、侵袭迁移相关。2.过表达miR-148a-3p可使非小细胞肺癌细胞系发生G1期周期阻滞,克隆形成能力抑制,侵袭迁移能力降低。3.MiR-148a-3p可通过直接靶向SOS2抑制MAPK/ERK通路,下调c-fos调控肿瘤增殖侵袭迁移能力。