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第一部分反义HPV16 E6E7-EGFP重组质粒的构建及其对人宫颈癌细胞凋亡及衰老方面的影响目的:人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus 16, HPV16)的早期基因E6、E7可分别诱导p53的泛素化降解和pRb的高磷酸化失活,与宫颈癌的发生发展关系密切。本研究通过真核表达载体介导HPV16型E6、E7基因反义RNA在SiHa细胞中的表达,以探讨反义RNA能否能降低E6、E7基因的表达,诱导细胞凋亡或衰老发生。方法:利用pEGFP构建HPV16型E6、E7基因反义RNA的真核表达载体并转染SiHa细胞,利用RT-PCR和Western blot技术检测转染后E6、E7基因的mRNA和蛋白的变化,利用MTT法检测SiHa细胞转染后细胞增殖活性,利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测转染后细胞的凋亡以及通过细胞形态学观察及β-gal染色来确定细胞衰老情况。结果:转染携带HPV16型E6、E7反义RNA的质粒后,SiHa细胞的E6、E7基因的mRNA和蛋白均明显下调;MTT结果显示转染后细胞的增殖活性(0.502±0.050)与转染空载体细胞(1.010±0.055)和未转染细胞(1.283±0.058)比较明显降低(P<0.05);流式细胞仪检测结果示转染后细胞凋亡率(59.3±11.3)%与转染空载体细胞(9.4±1.8)%和未转染细胞(2.1±0.4)%比较有显著性差异(P<0.05)。激光共聚焦显微镜结果示转染后细胞凋亡明显增多;并且HPV16型E6、E7反义RNA使细胞形态学发生改变,细胞变大,变扁平,衰老特异性的β-gal染色阳性明显增多。结论:HPV16型E6、E7基因反义RNA可降低宫颈癌细胞中E6、E7癌基因的表达,抑制细胞增殖,诱导宫颈癌细胞发生凋亡及衰老。第二部分利用反义技术抑制HPV18 E6E7的表达及其对宫颈癌HeLa细胞增殖凋亡的影响目的:构建HPV18型E6E7反义荧光真核表达载体,研究其对宫颈癌HeLa细胞增殖凋亡的影响。方法:以PCR法扩增HPV18型E6E7区716bp片段并反向克隆到荧光真核表达载体pEGFP-C1,构建重组体pEGFP-HPV18E6E7as(EGFP-18AS)并转染人宫颈癌HeLa细胞。利用RT-PCR和Western blot技术检测转染后E6、E7基因在mRNA和蛋白水平的变化;用MTT法检测转染后细胞的的增殖活性;用流式细胞仪检测转染后细胞的凋亡率;荧光显微镜下观察凋亡细胞的形态学改变。结果:转染EGFP-18AS重组体后,HeLa细胞中E6、E7基因的mRNA表达和蛋白合成均明显下调;细胞增殖受到抑制;流式显示细胞凋亡率增加;同时在荧光显微镜下经Hoechst染色凋亡细胞出现染色质凝集、边集、碎裂等形态学改变。结论:重组质粒pEGFP-HPV18E6E7a(sEGFP-18AS)能有效地抑制人宫颈癌HeLa细胞的生长和增殖,诱导其凋亡,证明了反义RNA技术的有效性,为宫颈癌的基因治疗提供了一种新的可能的途径。第三部分靶向HPV16-E7的短发夹RNA对人宫颈癌SiHa细胞的促凋亡作用目的:HPV是宫颈癌发生的首要致病因素,其编码的E6和E7癌基因对宫颈病变的恶性转化及恶性表型的维持是至关重要的。针对E6和E7癌基因的分子治疗被证实是可行的,且同时下调E6和E7的表达将具有最有效的抗肿瘤的作用。本研究拟利用RNAi技术抑制E6和E7的表达并观察其对宫颈癌细胞的促凋亡作用。方法:利用pSIREN-DNR构建靶向HPV16-E7的真核表达载体(pSIREN-16E7)并转染人宫颈癌SiHa细胞,利用RT-PCR和Western blot技术检测转染后E6、E7基因的mRNA和蛋白的变化,利用MTT法检测SiHa细胞转染后细胞增殖活性,利用流式细胞仪检测转染后SiHa细胞的凋亡率。结果:转染pSIREN-16E7质粒后,SiHa细胞中E6、E7基因在mRNA和蛋白水平的表达均明显下调;MTT结果显示转染-16E7质粒后第三天细胞的存活率明显下降(40.5±3.2%),与转染pSIREN-luc对照质粒(98.7±5.09%)相比统计学上差异有显著性意义(P<0.05);流式细胞仪检测结果示转染pSIREN-16E7后细胞凋亡率(51.3±10.6%)与转染pSIREN-luc(9.5±2.8)%比较明显增加,其差异有统计学意义(P<0.05)。结论:靶向HPV16-E7的短发夹RNA作为一种新型的基因治疗技术,可有效降低宫颈癌细胞中E6、E7癌基因的表达,抑制细胞增殖,诱导宫颈癌细胞发生凋亡。