中国是主要的苹果生产国,苹果栽培的面积和产量占世界产量的一半以上,而在中国的苹果产区,土壤盐渍化特别是次生盐渍化发生普遍,严重制约了我国苹果产业的发展。如何抵御土壤盐害,对提高苹果生产效益和果实品质具有重要意义。糖在植物的生理代谢、生长发育中起重要作用,它不仅为植物生长提供能量的能源供应物质,而且是决定某些农副产品质量和商品价值的关键。碳水化合物可作为植物生长发育的碳骨架,提高植物对非生物胁迫的抵抗力。糖代谢是植物生物代谢过程中的一个重要环节,是脂质代谢和核酸代谢的信息载体,为细胞的生长发育提供足够的营养物质。前期研究发现,苹果MdCIPK13是一个盐胁迫应答CIPK（CBL-interacting protein kinase）蛋白激酶,能够与蔗糖转运蛋白MdSUT2.2相互作用,并在盐胁迫下磷酸化MdSUT2.2,提高其转运活性,从而促进苹果植株和果实的蔗糖累积,但MdCIPK13如何应答盐胁迫尚不清楚。CBL（Calcineurin B-like protein）蛋白作为CIPK蛋白的上游蛋白,能够通过与CIPK形成蛋白复合体,响应多种胁迫信号,在拟南芥中,棕榈酰基转移酶蛋白（Protein Acyl-Transferase,PAT）与CBL互作应答盐胁迫,但响应盐胁迫的机理并不清楚。基于上述研究,我们推测棕榈酰基转移酶蛋白可能通过MdCBLs调控MdCIPK13-MdSUT2.2的功能。通过转录组数据与荧光定量PCR数据相结合,鉴定得到了苹果中的一个棕榈酰基转移酶基因MdPAT16。通过遗传转化,得到了苹果MdPAT16过表达的转基因‘嘎拉’苹果组培苗,过表达以及RNAi的转基因发根苹果苗,以及过表达和RNAi的转基因愈伤组织。在此基础上,对苹果MdPAT16的功能进行了系统研究,得到了如下结果:1.棕榈酰基转移酶与苹果耐盐性及糖分累积密切相关。适度盐胁迫（1 mmol/L以及10 mmol/L的Na Cl处理）‘平邑甜茶’实生苗糖含量显著增加,表明盐胁迫与糖分累积密切相关。采用10μM的2-溴棕榈酸（2-BP,棕榈酰化抑制剂）处理‘平邑甜茶’实生苗,发现施加2-BP处理的植株较对照处理耐盐性显著降低,表明棕榈酰化能够影响植株的耐盐性。在苹果的全基因组中共鉴定得到了30个MdPAT家族成员,通过对30个成员的荧光定量PCR结果,结合转录组数据的交叉比对,确定了一个在盐胁迫下高表达的MdPATs,MdPAT16。通过对不同物种中的PAT16的蛋白序列进行比对发现,苹果中的MdPAT16与白梨（Pyrus×bretschneideri）的PAT16亲缘关系最为接近。MdPAT16的ORF全长为1146 bp,共编码381个氨基酸,对MdPAT16的蛋白序列进行结构域分析发现,MdPAT16的蛋白包含PAT家族特有的DHHC以及ANK结构域,属于典型的PAT家族成员;亚细胞定位分析表明,MdPAT16定位于细胞质膜上,q RT-PCR结果表明,MdPAT16受盐胁迫诱导。2.MdPAT16的功能鉴定。将MdPAT16全长的CDS连接GFP标签,以农杆菌侵染的方法获得了5个35S::MdPAT16-GFP的转基因苹果组培苗株系,其MdPAT16的m RNA水平以及蛋白水平均显著上调。以150 mmol/L的Na Cl处理MdPAT16过表达以及转入空载体的苹果株系,结果表明,MdPAT16的过表达株系盐抗性以及可溶性糖含量均显著高于对照组。同样,用发根农杆菌侵染得到了MdPAT16过表达（MdPAT16-OE）和沉默表达（MdPAT16-RNAi）的株系各三株,分别进行盐处理,并检测植株的糖含量。结果表明,在MdPAT16过表达株系中,抗盐性以及糖含量均有显著提升,而在MdPAT16-RNAi的株系中,抗盐性以及糖含量则显著下调,这些结果均表明,MdPAT16编码的棕榈酰基转移酶能够正调控抗盐性以及糖含量。为进一步验证MdPAT16是否编码一个棕榈酰基转移酶蛋白,将MdPAT16在酵母棕榈酰基转移酶突变体akr1中表达。功能互补实验表明,MdPAT16蛋白能够互补akr1棕榈酰基转移酶缺失的表型,而MdPAT16的DHHC结构域突变体MdPAT16C244A则失去弥补棕榈酰基转移酶缺失表型的能力,且酰基-生物素交换实验同样证明MdPAT16有自棕榈酰化的活性,这些结果表明MdPAT16是一个典型的棕榈酰基转移酶蛋白。3.MdPAT16与MdCBL1蛋白相互作用。为进一步验证MdPAT16是如何发挥抵御盐胁迫,促进糖累积的功能,利用苹果愈伤组织进行了一系列遗传转化和相关分析,发现MdCBL1可能与MdPAT16相互作用。随后,采用Co-IP、Pull-Down和Bi FC试验,在体内以及体外分别验证了二者的互作关系。同时,双荧光素酶互补实验进一步验证了MdPAT16与MdCBL1的互作。在互作的基础上加入Na Cl,发现外施Na Cl能够显著提高二者互作强度。体内Co-IP实验证明MdPAT16能够将MdCBL1棕榈酰化,同时,ABE实验结果表明,MdCBL1的第3位半胱氨酸残基是发生棕榈酰化的关键位点;MdCBL1棕榈酰化的缺失会导致MdCBL1的亚细胞定位由质膜迁移到细胞核和胞质中;蛋白降解实验同样表明,MdPAT16通过棕榈酰化,稳定了MdCBL1的蛋白表达。4.MdPAT16通过MdCBL1调控苹果糖分含量。为进一步分析MdPAT16是如何调控糖含量的,用发根农杆菌介导转化的方式,获得了MdCBL1过表达、沉默以及第3位半胱氨酸残基突变的转基因根系。对转基因苹果根系和糖含量的检测表明,MdCBL1能够促进糖的积累;在MdPAT16过表达的背景上,进行了一系列瞬时表达试验,发现共注射果实也表现出相同的结果。因此,MdPAT16可能通过棕榈酰化MdCBL1调控糖和花青苷积累。之前的研究证明,MdCBL1/MdCIPK13-MdSUT2.2通路可以在液泡内诱导糖的积累,鉴于MdCBL1与MdCIPK13之间的相互作用,推测MdCIPK13参与MdPAT16对盐胁迫应答和糖累积的调节过程。为验证上述假说,利用病毒载体对苹果果实进行了瞬时表达试验,构建了过表达载体MdCIPK13-IL60与抑制载体MdCIPK13-TRV,并进行苹果果实注射试验。发现MdCIPK13-IL60可促进苹果果实内的糖积累,MdCIPK13-TRV则可抑制糖类积累。此外,MdCIPK13-TRV抑制了MdPAT16-IL60+MdCIPK13-TRV共注射导致的糖积累,表明MdCIPK13参与了MdPAT16-MdCBL1介导的糖分积累。