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2009年4月,一种新型的A型流感病毒在墨西哥和美国爆发,随后这种新出现的流感病毒快速的造成了21世纪第一次人类流感大流行。遗传学和系统发育进化分析显示H1N1/2009病毒是由猪群中多种谱系猪流感病毒病毒重排产生的。然而,系统发育进化分析还显示H1N1/2009分离株相对于其祖先猪流感病毒还具有一个较长的进化臂。因此,H1N1/2009病毒被认为是由一个重排的前体病毒从猪群中进化而来,但是由于缺少直接的流行病学监测证据,具有与H1N1/2009病毒相同重排模式的病毒从未被发现过。因而,H1N1/2009病毒的产生一直是一个悬而未决的科学问题。为了模拟H1N1/2009病毒的产生途径,本研究将一株之前本实验室构建的与H1N1/2009病毒的基因组合方式一致的重排病毒(rH1N1)在猪体内连续传代,然后通过深度测序和基因组测序分析rH1N1传代病毒的遗传变异特征,并以猪、豚鼠、雪貂等动物模型研究了rH1N1传代病毒的致病性和传播性。研究发现,传至第九代时,传代病毒感染的猪出现明显的临床症状,包括发热、气喘、咳嗽等。从第九代猪体内采集了病毒样本,并对其遗传变异进行了系统的分析。深度测序结果发现第九代猪上、下呼吸道病毒准种中存在五个一致性突变,它们分别是PB1A469T、PA I129T、NA N329D、NS1N205K和NEP T48N。除了这五个一致性突变,上、下呼吸道中病毒的HA蛋白上还存在变异,并且这些变异位点并不相同。其中上呼吸道中HA的主要变异位点是M2271、S271P和1295V,下呼吸道中HA的主要变异位点是D187E、K211E和S289N。随后,本研究利用噬斑纯化技术从上、下呼吸道的病毒粒子群中纯化了40株单克隆病毒株,并对它们进行全基因组测序,然后从中筛选出了三株代表性病毒克隆。体外特性鉴定结果表明,这三株第九代病毒克隆与亲本rH1N1病毒相比具有显著增强的体外复制力和聚合酶活性,其中PB1A469T突变对于聚合酶活性的增强起到决定性作用；此外,三株第九代病毒克隆均保留了亲本病毒的人样α2,6受体结合特性。动物试验表明,三株第九代病毒克隆在猪和雪貂中均具有增强的复制力和致病性。同居试验确证三株第九代病毒克隆在猪和豚鼠中均具备了接触传播力,并且PB1A469T和NS1N205K&NEP T48N突变对于豚鼠间接触传播力的产生至关重要。值得注意的是,雪貂试验还证明携带HAD187E,K211E,S289N变异的肺病毒克隆还具备了在雪貂间呼吸道飞沫传播的能力,这表明HA基因变异对于呼吸道飞沫传播有具重要的作用。综上所述,本研究发现流感病毒在猪体内连续传代后能够产生增强的致病性和传播性,并且这些在猪体内自然产生的传代病毒具有与H1N1/2009大流行流感病毒类似的生物学特性。研究结果表明,单独的猪宿主就有能力使基因片段均为猪源的流感病毒获得在人类流行的潜力,因此,H1N1/2009大流行流感病毒有很大的可能是从猪宿主开始产生的。本研究强调了持续监测猪流感病毒的重要性。