背景肺炎克雷伯菌是人类呼吸道和肠道的常见菌,也是重要的条件致病菌,可引起呼吸道、泌尿道、肠道、血液、手术切口、皮肤软组织等多个部位感染。嗜麦芽窄食单胞菌也是条件致病菌,不仅广泛分布于自然界,人类的皮肤、口咽部、上呼吸道和肠道也均有该菌寄居,在医院环境和医务人员中的分离率也很高；近年来嗜麦芽窄食单胞菌所致感染不断上升,已成为医院内感染的重要致病菌。铜绿假单胞菌是一种常见的条件致病菌,广泛分布于自然界、正常人皮肤、肠道、呼吸道及医院病房、医疗器械等,是目前医院内感染的主要致病菌之一；在机体抵抗力下降时(例如感染、手术、肿瘤化疗、烧伤及气管切开等各种侵袭性医学操作)能引起人体局部或全身性感染。以上三种革兰氏阴性菌在医院感染中占有越来越重要的地位,因此,深入了解这三种细菌引起的医院感染分子流行病学特点及其耐药特点,对预防和控制医院感染有重要意义。研究内容和目的(1)了解广东地区医院感染肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌以及铜绿假单胞菌的分布特点,并采用脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrothotesis PFGE)将临床分离到的上述三种革兰氏阴性菌进行基因分型,分析医院感染菌株的同源性。(2)了解广东地区肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌、铜绿假单胞菌感染的耐药特征,并探讨不同医院来源菌株耐药率的差异以及菌株耐药谱与基因型之间的关系。(3)通过PCR对多重耐药菌株进行扩增及整合子分类,了解肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌中Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类整合子(IntⅠ、IntⅡ、IntⅢ)的携带现状。(4)对整合子阳性菌株进一步检测整合子的可变区,分析插入基因盒的序列,了解菌株所携带的耐药基因盒的种类、特点及与菌株耐药的关系。(5)了解广东地区肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌、铜绿假单胞菌携带耐消毒剂基因qacEΔ1的情况,及qacEΔ1阳性菌株对医院常用消毒剂抗力与qacEΔ1阴性菌株、标准菌株之间的差异。方法(1)收集广东地区5家三级甲等综合和专科医院临床分离的医院感染肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌和铜绿假单胞菌。所有菌株经生化鉴定,疑难菌株进一步经VITEK 232型全自动细菌鉴定仪鉴定确认。同时对收集的医院感染病例资料进行描述性分析。(2)采用脉冲场凝胶电泳对广东地区5家医院临床分离的肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌、铜绿假单胞菌进行基因分型,明确是否为同一菌株的克隆。(3)采用药敏试验(K-B纸片扩散法)检测上述三种医院感染革兰氏阴性菌对16种常用抗菌药物的耐药率情况,并选取耐药谱相同的菌株进行PFGE基因分型比较分析。(4)根据文献报道以及NCBI序列,选择目标基因保守片段进行高特异PCR检测,了解上述菌株携带IntⅠ、IntⅡ、IntⅢ、情况。(5)对整合子阳性菌株进一步以保守序列引物扩增,对可变区扩增产物测序分析,所得结果在GenBank数据库中进行同源性比对,了解可变区中含有的基因盒及其携带耐药基因。(6)根据耐消毒剂基因qacEΔ1序列设计引物,应用PCR方法检测肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌、铜绿假单胞菌携带耐消毒剂基因qacEΔ1的情况。(7)采用定量杀菌试验,研究qacEΔ1阳性菌株对医院常用消毒剂抗力与qacEΔ1阴性菌株、标准菌株之间的差异。(8)统计方法在Epidata 3.0建立数据库,数据进行双录入,用SPSS 13.0软件进行数据分析。样本率的比较用χ2检验。结果(1)2009年1月～2010年6月,在广东省5家三级甲等综合和专科医院收集的医院感染病例标本中共分离出160株肺炎克雷伯菌、134株嗜麦芽窄食单胞菌和243株铜绿假单胞菌。其中广州市胸科医院分离的肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌最多,分别占总数的32.5%(52/160)和30.9%(75/243)；深圳市儿童医院分离的嗜麦芽窄食单胞菌最多,占总数的35.8%(48/134)。汕头市中心医院和汕头大学医学院附属第一医院分离的三种医院感染革兰氏阴性菌处于中等水平,广东药学院附属第一医院分离的菌株数量最少。各年龄组上述三种革兰氏阴性菌分布趋势图呈“U”型,菌株主要来源于<1岁组、66-75岁和75岁以上感染较多,提示老年人和婴幼儿是医院感染的重点预防对象。菌株来源按科室由高至低进行排序,前6位分别ICU、新生儿病房、神经内科、肿瘤科、血液科。因此,ICU、新生儿病房、呼吸内科是医院感染监控的重点科室。肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞和嗜麦芽窄食单胞菌主要分离于呼吸道、泌尿道、败血症和手术相关部位。(2)160株肺炎克雷伯菌、134株嗜麦芽窄食单胞菌和243株铜绿假单胞菌经酶切的染色体DNA在脉冲场中电泳成像后,显示13～20条大小不等的DNA片断,PFGE基因图谱经Bionumerics V4.0软件聚类分析,相似值在25.1%～100%之间,广州市胸科医院的3号与11号,19号与20号,22号与23号,25号与26号及54号与64号,深圳市儿童医院的2号与5号及4号与8号肺炎克雷伯菌；广东药学院附属第一医院的2号与5号,深圳儿童医院1号与50号、7号与8号以及28号、33号和39号,汕头市中心医院的50号与61号嗜麦芽窄食单胞菌；广东药学院附属第一医院的3号与8号,广州胸科市医院的38号与39号,47号与57号及27号与62号,深圳市儿童医院的8号与19号及64号与65号,23号、24号、37号以及2号、3号、9号,汕头市中心医院的3号与4号,17号与18号及10号与13号铜绿假单胞菌完全同源,多发生在同一医院的同一病房或病区；其余菌株则显示了较低的同源性或者无同源性。(3)肺炎克雷伯菌耐药率超过50%的常用抗生素依次为氨苄西林、哌拉西林、头孢氨苄、头孢唑啉、氨曲南、复方新诺明、头孢他啶和庆大霉素；嗜麦芽窄食单胞菌对大部分常用抗生素耐药,除复方新诺明、头孢吡肟、环丙沙星、左氧氟沙星和哌拉西林/他唑巴坦外,耐药率均超过50%；铜绿假单胞菌耐药率大于50%的常用抗菌药物依次为复方新诺明、头孢唑啉、氨苄西林、头孢噻肟、头孢氨苄和哌拉西林。(4)在广州市胸科医院的PFGE聚类分析图谱中,观察5对完全同源的肺炎克雷伯菌株的耐药谱,发现除3号与11号的耐药谱表现完全一致外,其他4对均有不同程度且没有规律的区别,说明同一种基因型可表现为不同的耐药表型。同时,发现37号与51号肺炎克雷伯菌,耐药谱完全相同,然而经聚类分析,其相似值仅为68.8%。选取耐药谱相同的7株嗜麦芽窄食单胞菌和22株铜绿假单胞菌经PFGE聚类分析图谱,发现也存在上述类似情况。(5)30株肺炎克雷伯菌中检出11株(36.67%)(11/30)携带IntⅠ、17株(56.67%)(17/30)携带IntⅡ,未检出携带Ⅲ类整合子基因；30株嗜麦芽窄食单胞菌中检出7株(23.33%)(7/30)携带IntⅠ,未检出携带Ⅱ、Ⅱ类整合子基因；30株铜绿假单胞菌中检出23株(76.67%)(23/30)携带IntⅠ,7株携带(23.33%)(7/30)IntⅡ,1株(3.33%)(1/30)携带IntⅢ基因。(6)IntⅠ和IntⅡ均为阳性的肺炎克雷伯菌有3株,为广东药学院附属第一医院的2037号和2997号菌株,以及广州市胸科医院的21号菌株。IntⅠ和IntⅡ均为阳性的铜绿假单胞菌有7株,分别为广东药学院附属第一医院的2669号菌株,广州市胸科医院的15号和24号以及深圳儿童医院的3、9、26、27号菌株。IntⅠ和IntⅢ均为阳性的铜绿假单胞菌有1株,为广东药学院附属第一医院的3159号菌株。(7)IntⅠ阳性肺炎克雷伯菌的可变区长度为502bp、IntⅠ阳性嗜麦芽窄食单胞菌的可变区长度为3610bp、IntⅠ阳性铜绿假单胞菌的可变区长度为1679bp；IntⅡ阳性肺炎克雷伯菌的可变区长度为776bp、IntⅡ阳性铜绿假单胞菌的可变区长度为1070bp；IntⅢ阳性铜绿假单胞菌的可变区长度为1250bp。(8)经对可变区扩增产物的测序及序列分析共得到6种整合子耐药基因盒的组合形式,IntⅠ阳性肺炎克雷伯菌可变区经测序得到cmlA耐药基因盒的组合形式,cmlA耐药基因盒表达对氯霉素类抗生素耐药。IntⅡ阳性肺炎克雷伯菌可变区经测序得到aadA4耐药基因盒的组合形式,其中aadA(对氨基甙类抗生素耐药)基因盒是最常见的基因盒,对照该菌株的耐药谱,与其对庆大霉素、阿米卡星耐药的特性相吻合。IntⅠ阳性的嗜麦芽窄食单胞菌可变区经测序得到aac-7+Oxa-7+blap+aadB+ORF-E耐药基因盒的组合方式,该株嗜麦芽窄食单胞菌耐药性分析显示,其除对哌拉西林/他唑巴坦敏感外,对氨基糖甙类、p内酰胺类、喹诺酮类、碳青霉烯类、磺胺类等15种抗生素耐药性严重。随机选取1株IntⅠ阳性、1株IntⅡ和IntⅢ阳性的铜绿假单胞菌进行整合子可变区阳性扩增产物的测序及序列分析,结果显示,Ⅰ类整合子经测序得到aac-3+aad2的组合形式；Ⅱ类整合子经测序得到Cm1A耐药基因盒；Ⅲ类整合子得到bla-MAP耐药基因盒。其中aad-3和aad2为氨基糖甙类抗生素耐药基因盒；Cm1A为氯霉素耐药基因盒；bla-MAP为金属β-内酰胺酶耐药基因盒,均与三株铜绿假单胞菌的耐药特性相对应。(9)在30株肺炎克雷伯菌中检出11例耐消毒剂基因qacEΔ1阳性(36.67%)(11/30)；在30株嗜麦芽窄食单胞菌中检出4株阳性(13.33%)(4/30)；在30株铜绿假单胞菌中检出26株阳性(86.67%)(26/30)。(10)有效碘浓度为200mg/L和150mg/L时,作用时间7min,仍分别有7.7%和15.4%耐消毒剂基因qacEΔ1阳性铜绿假单胞菌及6.7%和10.0%耐消毒剂基因qacEΔ1阴性铜绿假单胞菌的临床分离株存活。苯扎氯铵浓度为300mg/L和250mg/L时,作用时间7min,仍分别有11.5%和15.4%耐消毒剂基因qacEΔ1阳性及6.7%和20.0%耐消毒剂基因qacEΔ1阴性铜绿假单胞菌的临床分离株存活。有效氯浓度为500mg/L和375mg/L时,作用时间10min,仍分别有19.2%和38.5%耐消毒剂基因qacEΔ1阳性及10.0%和36.7%耐消毒剂基因qacEΔ1阴性铜绿假单胞菌的临床分离株存活。结论(1)广东地区160株肺炎克雷伯菌、134株嗜麦芽窄食单胞菌和243株铜绿假单胞菌引起的医院感染中,以<1岁组、66-75岁和75岁以上多见；科室分布,前6位分别为ICU、新生儿病房、神经内科、肿瘤科、血液科；标本来源以痰标本为主,主要分离于呼吸道、泌尿道、败血症和手术相关部位。(2)分子流行病学分析显示,广东地区5家医院收集的肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌和铜绿假单胞菌为多克隆构成,表现为基因多态性,说明监测期间的医院感染病例主要为散发。(3)160株肺炎克雷伯菌、134株嗜麦芽窄食单胞菌和243株铜绿假单胞菌均多为多重耐药菌株,PFGE图谱和耐药谱比较可以看出,同一克隆型的菌株对抗生素的耐药谱不尽相同,而不同克隆型的菌株也可拥有完全相同的抗生素耐药谱,提示菌株的基因型与抗生素耐药谱之间并无必然联系。(4)本研究发现铜绿假单胞菌Ⅰ类整合子的检出率最高,肺炎克雷伯菌Ⅱ类整合子的检出率最高,嗜麦芽窄食单胞菌未检出携带Ⅱ、Ⅲ类整合子基因。其中30株铜绿假单胞菌中检出1株(3.33%)携带IntⅢ基因,为国内首次报道。(5)经对可变区扩增产物的测序及序列分析共得到6种整合子耐药基因盒的组合形式,其中aad-3和aad2为氨基糖甙类抗生素耐药基因盒,Cm1A为氯霉素耐药基因盒；bla-MAP为金属β-内酰胺酶耐药基因盒。(6)耐消毒剂基因qacEΔ1在30株肺炎克雷伯菌中检出11株阳性(36.67%)；在30株嗜麦芽窄食单胞菌中检出4株阳性(13.33%)；在30株铜绿假单胞菌中检出26株阳性(86.67%)。(7)耐消毒剂基因qacEΔ1阳性的铜绿假单胞菌对碘伏、苯扎氯铵和有效氯消毒剂抗力均比qacEΔ1阴性株和标准株高。