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背景脓毒症心肌损伤是临床常见危重症的并发症,也是导致ICU患者高死亡率的重要原因。随着对脓毒症心肌损伤发病机制的深入研究,发现多种因素可能共同参与其病理生理过程,其中炎症因子的过度释放可能是该疾病的始动因素。NF-κB信号通路已成为公认的活化炎症因子的经典途径,作为激活NF-κB信号通路的Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)成为治疗脓毒症心肌损伤的参考靶点。黄芪多糖(Astragalus Polysaccharides,APS)作为常见的传统中药,具有免疫调节、抗感染、抗氧化等药理作用,且可与TLR4结合发挥调节炎症因子释放的功能。但这种亲水性大分子物质很难穿透细胞膜,或只有很少部分可以通过细胞间隙被吸收。为解决黄芪多糖临床应用难题,本研究借助纳米技术制备成黄芪多糖纳米药物,对脓毒症心肌损伤进行干预,探索其作用机制,为中医药应用于脓毒症心肌损伤的治疗提供新的方法与思路。目的通过构建黄芪多糖纳米药物,评价该纳米药物在体内、体外对脓毒症心肌损伤模型的治疗效果,进一步探讨黄芪多糖纳米药物治疗脓毒症心肌损伤小鼠的可能机制。方法1.构建黄芪多糖纳米药物并分析其特性根据离子交联原理制备黄芪多糖纳米药物(以下简称APS-CS/TPP纳米药物)。利用红外吸收光谱分析该纳米药物的特征吸收峰,明确黄芪多糖结合在壳聚糖纳米载体(以下简称CS/TPP)上,并采用扫描电镜观察该纳米药物的形貌特点。然后通过检测APS-CS/TPP纳米药物的粒径、Zeta电位及分散指数,表征其大小、分布及稳定性等物理特性。最后将APS-CS/TPP纳米药物与大鼠心肌细胞系(H9c2细胞)共培养,通过检测细胞增值率的变化,评价该药物的细胞相容性。2.APS-CS/TPP纳米药物对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的H9c2损伤细胞的影响取H9c2细胞分为5组,分别为正常对照组(Control组)、模型对照组(LPS+PBS组)、黄芪多糖组(LPS+APS组)、壳聚糖纳米粒子组(LPS+CS/TPP组)和黄芪多糖纳米药物组(LPS+APS-CS/TPP组)。按照5×10~4个细胞/孔接种于培养板,培养4 h待贴壁后各组分别给予10μl PBS缓冲液、50μg/ml的黄芪多糖、CS/TPP和APS-CS/TPP纳米药物。孵育24 h后,再加入10μg/ml的LPS作用24 h。Control组只加入PBS缓冲液。采用MTT法检测细胞增值率的变化,瑞士染色观察细胞形态,然后通过DAPI和Mito tracker染色观察凋亡细胞核和线粒体形态,流式细胞术检测细胞凋亡数量以及DCFH-DA探针法检测H9c2细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。3.APS-CS/TPP纳米药物对脓毒症心肌损伤小鼠的治疗效果将90只C57BL/6雄性小鼠随机分成假手术对照组(Control组)、模型对照组(CLP+NS组)、黄芪多糖组(CLP+APS组)、壳聚糖纳米粒子组(CLP+CS/TPP组)和黄芪多糖纳米药物组(CLP+APS-CS/TPP组)。Control组打开腹腔后取出盲肠,复位后缝合。其余各组按照盲肠结扎穿孔(Caecal ligation perforation,CLP)方法建立脓毒症模型,并在CLP术前72 h、48 h和24 h与术后6 h、12 h和24 h分别灌胃给予0.5 ml生理盐水、200 mg/kg的黄芪多糖、CS/TPP和APS-CS/TPP纳米药物。在CLP术后6 h、12 h和24 h比较各组外周血中的细菌载量、WBC、C反应蛋白和肌钙蛋白(cardiac troponin I,cTnI)水平的变化,并分析各组心肌组织病理学的改变。4.探索APS-CS/TPP纳米药物治疗脓毒症心肌损伤小鼠的机制APS-CS/TPP纳米药物治疗脓毒症心肌损伤小鼠后,利用蛋白芯片技术检测心肌组织细胞因子水平,实时定量PCR方法检测小鼠心肌组织tlr4、p38和Nf-κB的mRNA水平,免疫印迹方法检测小鼠心肌组织TLR4、p38和NF-κB蛋白表达,探讨APS-CS/TPP纳米药物对小鼠心肌组织TLR-4/NF-κB信号通路的关键分子的影响;采用蛋白芯片技术测定血清细胞因子变化,ELISA法检测血清丝氨酸相关的蛋白酶-2(MBL-associated serine proteases,MASP-2)、C4a、C3a和C5a水平,流式细胞术检测脾脏T细胞亚群比例,探索APS-CS/TPP纳米药物对脓毒症心肌损伤小鼠免疫水平的调节。结果1.成功构建APS-CS/TPP纳米药物且性质稳定根据最小的载体粒径和最高的纳米药物包封率,选择壳聚糖(Chitosan,CS)浓度为2 mg/ml、三聚磷酸钠(sodium tyipolyphosphate,TPP)浓度为1 mg/ml、黄芪多糖为1 mg/ml的条件制备APS-CS/TPP纳米药物。该药物的红外吸收光谱在618.3 cm-1处出现特征吸收峰,证明APS-CS/TPP纳米药物制备成功。进一步用扫描电镜观察该纳米药物分布均匀;平均粒径为110±5.09 nm;zeta电位为43.6±0.21 mV,带正电荷,且性质稳定。该纳米药物对H9c2细胞无明显细胞毒作用,具有良好的生物相容性。2.APS-CS/TPP纳米药物具有抵抗LPS诱导H9c2细胞损伤的作用LPS诱导的H9c2细胞给予APS-CS/TPP纳米药物后,细胞活力与对照组相比,增长50%以上。较LPS+PBS组升高约2倍左右,有显著性差异(P=0.003)。LPS+APS-CS/TPP组H9c2细胞生长状态良好,细胞形态也未出现明显变化,且细胞早期凋亡率为47.33%±10.33,较LPS+PBS组降低了30%左右,有显著性差异(P=0.000)。ROS水平也比LPS+PBS组降低了2倍左右,差异具有显著性(P=0.013)。3.APS-CS/TPP纳米药物可保护CLP术后小鼠的心肌损伤CLP方法建立脓毒症心肌损伤小鼠模型,给予APS-CS/TPP纳米药物治疗后发现,CLP术后虽然外周血细菌载量呈时间依赖性升高,但术后12 h CLP+APS-CS/TPP组的细菌总数较CLP+NS组显著降低,24 h后较其降低两倍左右,差异有统计学意义(P=0.000)。外周血WBC和C反应蛋白在CLP+APS-CS/TPP组虽呈上升趋势,但明显低于CLP+NS组。cTnI在CLP+APS-CS/TPP组明显降低,与CLP+NS组比,差异有统计学意义(P=0.000)。病理形态学观察心肌细胞在APS-CS/TPP纳米药物治疗后肿胀明显减轻,无明显出血,仅见少量炎性细胞浸润。CLP术后24 h病理损伤评分结果为1.78±0.48,较CLP+NS组明显降低,差异有统计学意义(P=0.000)。4.APS-CS/TPP纳米药物通过TLR-4/NF-κB信号通路和免疫调节作用发挥保护脓毒症心肌损伤作用在CLP方法建立脓毒症心肌损伤小鼠模型中发现,与CLP+NS组相比,CLP+APS-CS/TPP组心肌组织中的促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平下降了2倍以上,抑炎细胞因子IL-2、IL-4、IL-5和IL-10水平显著上调。tlr4、p38和Nf-κB的mRNA水平明显降低,TLR4、p38和NF-κB蛋白表达也降低。应用APS-CS/TPP纳米药物后,与CLP+NS组相比,小鼠脾脏中的CD4~+T和CD8~+T细胞百分比明显升高,但CD4~+CD25~+T细胞比例却显著下降。但APS-CS/TPP纳米药物对外周血中的细胞因子、MASP-2、C4a无明显调节作用,可显著降低血清中的C3a、C5a水平,且与CLP+NS组相比有显著性差异(P=0.000,P=0.011)。结论1.成功制备出APS-CS/TPP纳米药物,此纳米粒径均匀,形貌规整,生物相容性良好。2.APS-CS/TPP纳米药物对LPS诱导的H9c2细胞损伤具有保护效应。3.APS-CS/TPP纳米药物对CLP方法建立的脓毒症心肌损伤小鼠发挥抗感染作用。4.APS-CS/TPP纳米药物通过抑制TLR-4/NF-κB信号通路以及调节免疫水平发挥保护脓毒症心肌损伤的效应。