现代社会人口老龄化现象越来越严重,老年性痴呆(senile dementia)、帕金森病(Parkinson’s disease, PD)、脑卒中等疾病的发病率都有所升高,此外脑部的感染性疾病如人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染造成的痴呆症等,也严重危害着人类生命。脑部疾病与脑的能量代谢异常有密切关系,应用各种先进技术研究脑的能量代谢与脑部疾病的关系已成为当今脑部疾病研究的热点之一。葡萄糖是大脑供能的主要来源之一,也是大脑必需的能量底物,葡萄糖进入脑实质后,通过循环提供能量给神经元及其他多种细胞。脑部的能量代谢活动主要是通过葡萄糖的氧化代谢来实现的,葡萄糖的转运依赖于细胞膜上葡萄糖转运体(glucose transporter, GLUT)来完成。另外糖酵解产生的乳酸也可以为大脑供能,乳酸的转运依靠细胞膜上的单羧酸转运体(monocarboxylate transporter, MCT)来完成。研究发现,在血浆葡萄糖正常的时候乳酸优先被利用为大脑供应能量,与葡萄糖相比乳酸作为脑能量代谢的首选燃料,但是具体的作用机制尚未研究清楚。神经元上可检测到多种转运体,包括GLUT3、GLUT6、GLUT8和MCT2,他们分别通过不同的信号转导途径调节葡萄糖和乳酸的摄取。Toll样受体(toll-like receptors, TLRs)在天然免疫应答中扮演着重要的角色,并且在进化中高度保守。在哺乳动物中,TLRs能够识别保守的病毒或者细菌的结构成分也就是病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern, PAMPs)。TLRs识别配体后引起相关信号通路的活化,释放促炎性细胞因子,最终清除入侵的病原体。尽管在哺乳动物中TLRs主要在免疫系统中发挥作用,但是在神经元细胞中也存在着某些TLRs,并发挥其他重要作用。在大脑表达的TLRs家族成员主要有TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和TLR9。在果蝇胚胎发生和胚胎发育中,如突触发生、神经轴突的形成、轴突(输出端)方向等方面TLRs也扮演着重要的角色。在哺乳动物的中枢神经系统(central nervous system, CNS)中,TLRs在小神经胶质细胞和星形细胞中表达,并且在感染和组织损伤中高表达,TLRs在神经退行性变中可以活化炎性细胞。在鼠的胚胎发育过程中,TLR3抑制端脑的神经祖细胞的增殖并介导轴突的生长。TLR2和TLR4在成年的海马神经形成中也起到重要作用。TLR7在鼠脑发育中也有表达,且主要是在胚胎早期。TLR8在鼠脑的发育过程中动态表达,主要集中于神经元和轴突。用TLR8的配体刺激之后,能抑制神经突的生长并且介导凋亡。TLR9活化后影响神经元细胞内AMP/ATP值及对缺氧的耐受。在脂肪细胞中TLR3或TLR4活化后调节GLUT4的表达,影响葡萄糖摄取和脂肪分解。本实验室以往的研究发现,主要识别病毒双链RNA (dsRNA)的TLR3在神经元细胞的能量代谢中扮演重要的角色。TLR7和TLR8作为主要识别病毒单链RNA (ssRNA)的受体,是否也参与神经细胞的能量代谢及具体的信号通路是什么尚未见报道。因此,本课题主要研究的是TLR7/8活化对神经元细胞表达在能量代谢中起关键作用的GLUTs和MCTs有何影响,并探讨其相关机制,以期从新的角度探讨脑内表达TLR7/8在脑疾病中的作用。一、TLR7/8活化对神经元细胞活性的影响为了探讨TLR7或TLR8活化对神经元细胞存活状态的影响,本实验首先建立原代胎鼠大脑皮质神经元体外培养体系,用TLR7的特异性配体Loxoribine或TLR7/8配体CL075(3M-002,优先作用于TLR8)刺激所培养的神经元细胞,观察作用后的不同时间点细胞活性及凋亡情况。结果显示,建立的体外培养体系中神经元细胞纯度大于90%,能够用于后续的实验。Loxoribine或CL075 (3M-002)刺激所培养的神经元细胞后,经CCK8法检测显示,两种配体都能够引起神经元细胞活性显著降低,流式细胞术(flow cytometry, FCM)分析结果也表明,与对照组相比神经元的凋亡增多。进一步我们合成了TLR7的干扰小RNA (siRNA),分别用两种配体刺激经siRNA干扰的皮质神经元细胞,结果显示同对照组相比细胞的活性没有发生明显的变化,FCM结果也显示神经元的凋亡没有显著增加。因此,第一部分实验结果表明,TLR7/8活化能够降低神经元细胞的活性,并且导致神经元细胞出现凋亡。二、TLR7/8对神经元细胞表达GLUTs和MCTs的影响引起神经元细胞活性降低或凋亡的因素很多,如线粒体途径、caspase途径等,本实验主要是探讨TLR信号通路在脑神经元细胞能量代谢中的作用。因此,在这部分实验中,我们主要研究了TLR7的特异性配体Loxoribine与TLR7/8配体CL075(3M-002)是否对神经元细胞表达GLUTs与MCTs产生影响。首先用Loxoribine或CL075 (3M-002)与神经元细胞共孵育一定时间后,收集细胞抽提RNA和蛋白质来检测MCTs和GLUTs的表达。实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, Real-time qPCR)结果显示,Loxoribine能够下调MCT2、GLUT3和GLUT8 mRNA的表达水平,但是CL075(3M-002)可使MCT2和GLUT3 mRNA表达水平上调。免疫印迹(western blotting, WB)实验结果显示,Loxoribine作用于细胞后MCT2、GLUT3和GLUT8的蛋白表达水平同：mRNA表达一致,但是CL075 (3M-002)刺激细胞后仅引起MCT2蛋白表达增加。皮质神经元细胞预先用TLR7 siRNA处理后,再以Loxoribine刺激,同对照组比较MCT2、GLUT3和GLUT8表达水平没有明显差异；CL075 (3M-002)作用于细胞后,与对照组相比MCT2表达水平无明显变化。这些实验结果表明,Loxoribine刺激神经元细胞后,能够下调神经元细胞中MCT2、GLUT3和GLUT8 mRNA和蛋白表达水平；而CL075(3M-002)仅影响MCT2的表达水平。在神经元细胞转运葡萄糖和乳酸进行能量代谢过程中,TLR7和TLR8活化都发挥一定的作用。三、TLR7/8影响神经元表达GLUTs和MCTs的机制初探为了探讨TLR7/8活化后影响神经元细胞表达GLUTs和MCTs的相关机制,用Real-time qPCR法检测了Loxoribine或CL075 (3M-002)与神经元细胞共孵育后干扰素β (interferon-β,IFN-β)、干扰素α (interferon-α, IFN-α)、肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素6 (interleukin-6, IL-6) mRNAs表达的变化；用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测了神经元细胞分泌上述细胞因子水平的变化；以western blot检测TLR7/8信号通路相关分子干扰素调节因子3 (IFN regulatory factor 3, IRF3)、干扰素调节因子7 (IFN regulatory factor 7,IRF7)、p65等的磷酸化水平；用Real-time qPCR和western blot方法检测加入NF-κB信号通路抑制剂吡咯烷铵(ammonium pyrrolidinedithiocarbamate, PDTC)预处理再用Loxoribine或CL075 (3M-002)刺激后,神经元细胞GLUTs和MCTs mRNAs和蛋白表达变化。结果显示,Loxoribine或CL075(3M-002)可使神经元细胞表达TNF-α、IFN-α、 IFN-β及IL-6 mRNAs有不同程度的上调,但仅使IFN-p和IL-6的分泌水平增加。经TLR7的特异性配体Loxoribine处理后,神经元细胞IRF3、IRF7及p65的磷酸化水平上调。用NF-κB信号通路抑制剂PDTC处理细胞,然后用Loxoribine刺激,结果显示PDTC可以部分抑制Loxoribine下调神经元细胞MCT2、GLUT3和GLUT8表达的作用；而经过PDTC预处理神经元细胞后,CL075(3M-002)仅对MCT2的上调有一定的抑制作用,对GLUT3的表达无影响。这部分的实验结果提示,TLR7可能通过MyD88依赖的信号通路活化NF-κB来抑制神经元细胞表达MCT2、GLUT3和GLUT8,导致神经元细胞内能量代谢障碍,进而对神经元细胞的存活产生影响,细胞因子IFN-β和IL-6参与了此过程。但是TLR8影响神经元细胞表达MCT2的作用机制有待进一步探讨。