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第一部 分槐杞黄抗UUO大鼠肾间质纤维化的疗效观察目的 观察槐杞黄清膏对UUO模型大鼠肾间质病理损伤的影响。方法建立大鼠单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)肾间质纤维化模型。将50只Wistar大鼠随机分为5组,每组10只,分别为假手术组,UUO模型组,低、中、高剂量槐杞黄清膏(Huai Qi Huang, HQH)药物治疗组。UUO术后第3天开始,分别给予各治疗组大鼠槐杞黄清膏1.5、2.25、3.0g/kg/d生理盐水混悬剂灌胃。于术后第7、14天分别处死各组中5只大鼠,获取肾脏组织。梗阻侧肾脏组织行HE、Masson染色,在光镜下观察肾间质病理改变并进行肾间质损伤评分及纤维化程度评价。采用免疫组化方法检测肾间质α-SMA表达情况,显示肌成纤维细胞堆积程度；Western Blot方法检测梗阻侧肾组织α-SMA和TGFβ1蛋白表达水平。采用实时荧光PCR方法定量检测CTGF mRNA、FN mRNA基因表达。结果HE及Masson染色法显示,UUO大鼠术后7天梗阻侧肾脏间质可见明显纤维化病变；第14天,肾间质严重损伤并伴明显纤维化病变。免疫组化显示,肾间质纤维化区域伴有大量α-SMA+细胞广泛堆积,并随梗阻时间延长而逐渐增多；中、高剂量槐杞黄清膏治疗UUO大鼠后,肾间质区纤维沉积及α-SMA+细胞数量在7、14天时均明显减少。蛋白免疫印迹结果显示中、高剂量槐杞黄清膏可下调α-SMA蛋白。CTGF及FN mRNA水平在UUO大鼠梗阻侧肾脏中显著上调,而槐杞黄可明显抑制其表达。结论槐杞黄清膏可抑制肾间质纤维化,具有减少肾间质肌成纤维细胞聚集的作用。第二部分 槐杞黄对肾小管上皮细胞转分化的影响目的 探讨槐杞黄对肾小管上皮细胞转分化的影响。方法建立大鼠单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)肾间质纤维化模型。将50只Wistar大鼠随机分为5组,每组10只,分别为假手术组,UUO模型组,低、中、高剂量槐杞黄清膏(Huai Qi Huang,HQH)药物治疗组。UUO术后第3天开始,分别给予各治疗组大鼠槐杞黄清膏1.5、2.25、3.0g/kg/d生理盐水混悬剂灌胃。于术后第7、14天分别处死各组中5只大鼠,获取肾脏组织。采用免疫组化及蛋白印迹法检测各组大鼠梗阻肾E-cadherin蛋白表达情况。培养NRK-52E细胞,设立正常对照组、10ng/ml TGF01刺激模型组、TGFβ1+60 ug/ml槐杞黄治疗组、TGFβ1+120 ug/m槐杞黄治疗组、TGFβ1+180ug/m槐杞黄治疗组。药物干预前血清饥饿处理细胞12h,分别于干预后6h,12h,24,48h检测各组肾小管上皮细胞E-cadherin及α-SMA蛋白表达水平。采用免疫荧光检测干预后24h各组肾小管上皮细胞E-cadherin及α-SMA表达。结果假手术组大鼠肾小管上皮细胞E-cadherin蛋白高表达。UUO大鼠E-cadherin蛋白随梗阻时间延长而表达下降。TGFβ1 10 ng/ml刺激大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E后,随刺激时间延长,E-cadherin表达下调,而α-SMA蛋白表达上调。在体实验证实,槐杞黄可维持UUO大鼠梗阻肾组织中E-cadherin蛋白的表达水平。体外实验证明,槐杞黄可部分抑制由TGFβ1介导的NRK-52E细胞表型改变,维持其上皮细胞形态。槐杞黄以剂量和时间依赖方式有效下调由TGFβ1诱导的α-SMA蛋白,并维持E-cadherin蛋白水平。结论槐杞黄以剂量依赖方式维持大鼠肾小管细胞表型,并可直接抑制NRK-52E细胞上皮间质转分化。第三部分 槐杞黄对肾小管上皮细胞转分化作用的分子机制目的 探讨槐杞黄对肾小管上皮细胞信号通路中miR-200a/ZEBs信号轴的影响方法建立大鼠单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)’肾间质纤维化模型。将50只Wistar大鼠随机分为5组,每组10只,分别为假手术组,UUO模型组,低、中、高剂量槐杞黄清膏(Huai Qi Huang, HQH)药物治疗组。UUO术后第3天开始,分别给予各治疗组大鼠槐杞黄清膏1.5、2.25、3.0g/kg/d生理盐水混悬剂灌胃。于术后第7、14天分别处死各组中5只大鼠,获取肾脏组织。采用实时定量PCR方法检测各组大鼠梗阻侧肾组织中miR-200a, ZEB1 (Zinc finger E-box-binding protein-1, ZEB1)和ZEB2 mRNA表达水平,分析比较各组各个指标的表达量。TGFβ1 10ng/ml刺激大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E 3小时后,检测miR-200a,ZEB1和ZEB2 mRNA表达水平。结果实时定量PCR结果显示,假手术组大鼠肾脏组织高表达miR-200a,而ZEB1及ZEB2 mRNA几乎不表达。UUO大鼠miR-200a表达减少,ZEB1及ZEB2 mRNA表达升高。随梗阻时间延长,miR-200a逐渐减少,ZEB1及ZEB2 mRNA表达逐渐增加。槐杞黄各剂量组与模型组相比,miR-200a水平升高(p<0.05),ZEB1及ZEB2 mRNA水平显著降低(p<0.05)。TGFβ1刺激NRK-52E细胞后3小时,miR-200a表达下调(p<0.05),而ZEB1及ZEB2 mRNA表达上调(p<0.05)。槐杞黄共培养可维持miR200a水平(p<0.05),下调ZEB1及ZEB2 mRNA水平(p<0.05),呈量效依赖关系。结论槐杞黄可影响肾小管上皮细胞内miR-200a/ZEBs细胞信号通路。