无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)宿主广泛,不仅是人类和奶牛重要的致病菌,也是水生动物的主要病原一。近年来,无乳链球菌已成为罗非鱼重要致病菌,造成严重的经济损失,阻碍罗非鱼产业的健康发展。本研究聚焦罗非鱼无乳链球菌分子流行病学和耐药性,旨在为罗非鱼无乳链球菌病的防控提供科学依据。主要研究内容如下:1罗非鱼无乳链球菌检测方法的构建及2016年菌株的分离与鉴定根据无乳链球菌毒力基因hyl B、pon A和cfb的保守序列,设计引物,进行PCR反应条件和体系优化,构建特异性强、灵敏度高的三重PCR检测方法。结合常规的细菌分离与鉴定技术,在广东省2016年所采集的188个罗非鱼样本中,共分离到20株无乳链球菌,检出率为10.64%。2罗非鱼无乳链球菌的分子分型以2009-2016年从广东省分离的75株罗非鱼无乳链球菌为研究对象,运用分子血清型、多位点序列分型(MLST)和多毒力位点序列分型(MVLST)方法进行分子分型分析。结果显示,分子血清型均为Ia型,同样,MLST分型均为ST-7。进一步的MVLST分型则把75株无乳链球菌分成14(a—n)个毒力序列型,发现2014-2015年是三个毒力基因(srr-1、bib A和fbs A)出现分化的重要时间点:k、l和m毒力序列型为2014年之前的主要流行株,而a毒力序列型为2015年之后的主要流行株。此外,构建了三组七重PCR检测技术,对75株罗非鱼无乳链球菌、鱼源标准菌株(ATCC 51487)和人源标准菌株(ATCC BAA-1138)的21种毒力基因进行检测,发现所测罗非鱼无乳链球菌与鱼源标准菌株的毒力基因谱型均为V1,而人源标准菌(ATCC BAA-1138)毒力基因谱型为V2。表明广东省2009-2016年罗非鱼无乳链球菌菌株分子遗传多样性变异小,可能具有相同的起源或传染源。相比MLST分型,MVLST具有更佳的分辨率,可筛选出具有潜在能力的致病菌株。3无乳链球菌耐药谱及谱型聚类分析通过纸片扩散法(K-B法)对2009-2016年的75株罗非鱼无乳链球菌进行药物敏感性测定,并进行聚类分析。结果显示,所有菌株存在多重耐药性,对氨基糖苷类、磺胺类、吡哌酸和诺氟沙星耐药率最高(>90%),其次是青霉素G、氨苄青霉素和环丙沙星(37.3%、26.7%和38.7%),对喃妥因、林可霉素、红霉素、氧氟沙星、四环素和氟苯尼考等较低(<10%),对万古霉素、头孢氨苄、头孢西丁、阿莫西林和麦迪霉素则不耐药。菌株共具耐药谱型23种(A~X),谱型丰富度为30.7%。菌株谱型聚类分析得到5个组群(GroupsⅠ-Ⅴ),耐药率高的菌株主要聚类于组群GroupⅠ和GroupⅡ。研究表明,所测菌株耐药谱种类随时间不断更新扩大和地区差异性显著。将耐药谱分型结果与MVLST分型进行相关性分析,发现耐药组群GroupsⅠ-Ⅴ存在3-7个毒力序列型,同一毒力序列型在5个组群中均出现,表明谱型相似的分离株进化关系不一定相近,而毒力序列型相似的分离株出现多种耐药谱型。4无乳链球菌耐药基因检测利用微量稀释法测定无乳链球菌对环丙沙星的MIC值,发现纸片扩散法和微量稀释法检测无乳链球菌对环丙沙星的敏感性存在差异。扩增其靶基因(gyr A和par C)并测序,发现靶基因的QRDR区均未出现突变。通过PCR方法检测75株无乳链球菌的磺胺类耐药基因(sul1、sul2和sul3)和整合酶基因(int I1和int I2)携带率,结果显示,int I、sul1和sul2的检出率分别为100%、61.3%和45.3%,而sul3和int I2则为0,表明耐药基因的有无并不是菌株存在耐药性的唯一原因。