一、研究背景自体皮片移植是整形外科常用手术方法之一,在修复创面、改善外形、恢复功能等方面发挥了重要作用。但移植皮片成活后常伴有不同程度的过度色素沉着,从而影响了手术的美容效果,如何减轻移植皮片后的色素沉着是困扰整形外科医生的一大难题。本课题组在前期研究中发现α-黑素细胞刺激素(α-melanocyte-stimulating hormone,a-MSH)在自体移植皮片中呈过度表达,通过与黑素细胞表面特异性受体—黑皮素-1受体(melanocortin-1 receptor, MC-1R)结合后促进黑素细胞合成黑素增多,并促进黑素小体扩散,使自体移植皮片呈过度色素沉着表现。其他作者研究发现,钙信号转导途径参与α-MSH前体的合成、黑色素合成原材料的供给、黑素细胞增殖、酪氨酸酶的合成及黑素小体转运等多个环节,从而参与调控黑素细胞中黑素的合成。还有其他研究表明α-MSH与黑素细胞表面MC-1R结合可使细胞钙内流增加、胞内钙水平升高,激活细胞内钙信号转导途径。以上研究说明,α-MSH的合成、黑素细胞中酪氨酸酶的激活、黑素的合成等都需要钙信号的参与调节；因此,钙信号转导途径在自体移植皮片中对色素沉着的调控作用,以及其与α-MSH促进黑素细胞合成黑色素的通路之间的关系值得进一步研究。二、研究目的(一)检测CaM、IP3RI及TYR在人体自体移植皮片中的表达,并与自身正常皮肤作对照,认识钙信号转导途径在自体移植皮片过度色素沉着中的作用。(二)观察维拉帕米对人皮肤黑素细胞胞内钙离子浓度、细胞的增殖、CaM、TYR、IP3RI的表达及黑色素合成的影响,探讨钙信号转导途径在黑素细胞合成黑色素中的调控作用及环节。(三)观察维拉帕米与α-MSH共同作用后对人皮肤黑素细胞的增殖、CaM、TYR、IP3RI的表达及黑色素合成的影响,探讨钙信号转导途径与α-MSH在黑素细胞合成黑色素中相互作用。(四)观察维拉帕米在体内对自体移植皮片色素沉着的影响,进一步阐述钙信号转导途径对自体移植皮片色素沉着中的调控作用。三、研究内容和方法(一)利用免疫组织化学方法和Realtime-PCR方法分别检测自体移植皮片(刃厚、中厚及全厚皮片)与正常对照皮肤中CaM、TYR及IP3RI的表达情况,银染-丽春红(Masson Fontana-Ponceau)复合法检测自体移植皮片中黑色素的含量,并进行统计学分析。(二)用含不同浓度维拉帕米的条件培养基作用于人皮肤黑素细胞后,通过荧光抗体标记法检测黑素细胞胞内钙离子浓度、MTT法观察人皮肤黑素细胞的增殖,Western-blot及Realtime-PCR方法分别检测人皮肤黑素细胞中CaM、TYR及IP3RI蛋白和基因表达,多巴氧化法测定TYR活性的变化及NaOH裂解法测定细胞中黑素的含量,并进行统计学分析。(三)检测维拉帕米与a-MSH共同作用人黑素细胞后,细胞增殖、TYR活性、黑素含量、CaM、TYR及IP3RI的表达并与对照组相比较。(四)利用免疫组织化学方法及Realtime-PCR法分别检测维拉帕米作用前后豚鼠自体移植皮片中CaM和TYR的表达,银染-丽春红(Masson Fontana-Ponceau)复合法检测自体移植皮片表皮中黑色素的含量,并进行统计学分析。四、研究结果(一)应用免疫组织化学方法,观察到CaM的表达定位于表皮基底部黑素细胞、角质形成细胞胞质,TYR的表达定位于表皮基底部黑素细胞胞质,IP3RI的表达定位于表皮基底部黑素细胞、角质形成细胞的细胞质,它们在自体移植皮片中蛋白表达较正常皮肤明显上调；通过Realtime-PCR方法检测,CaM及TYR基因在自体移植皮片中的表达较正常皮肤亦明显上调。(二)维拉帕米能明显降低黑素细胞胞内钙离子浓度、抑制黑素细胞增殖、下调CaM和TYR的表达,降低TYR的活性而减少黑色素的合成。(三)维拉帕米通过抑制钙信号转导作用能拮抗a-MSH对黑素细胞合成黑色素的促进作用,抑制黑素细胞增殖、下调CaM和TYR的表达,降低TYR的活性而减少黑色素的合成。(四)利用免疫组织化学方法及Realtime-PCR法,在维拉帕米作用后皮片中黑素含量、CaM.TYR的蛋白及基因表达与未处理组相比均明显下调,差异有统计学意义,而与正常豚鼠相比差异无统计学意义。五、研究结论CaM在人自体移植皮片中的表达显著增高,刺激皮片黑素细胞合成黑色素增多,促进自体移植皮片过度色素沉着；维拉帕米作用于人黑素细胞后,能抑制黑素细胞增殖,抑制TYR的活性,减少黑素合成。维拉帕米与α-MSH共同作用黑素细胞后,细胞增殖下降,TYR活性下降,黑素细胞合成黑色素减少,说明维拉帕米在体外能拮抗α-MSH对黑素合成的促进作用。维拉帕米作用于自体移植皮片后能使皮片黑素细胞中酪氨酸酶的活性下降、皮片中黑色素含量降低,说明维拉帕米在体内亦能抑制黑素合成的作用,进一步说明了钙信号转导途径在自体移植皮片过度色素沉着中有重要调控作用。