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苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)被广泛应用于害虫防治,伴孢晶体蛋白(Cry)是其主要杀虫因子。Cry8蛋白对地下害虫蛴螬具有较高毒力,目前已有53个Cry8蛋白。害虫抗性发展和一些重要害虫仍缺乏相应有效的Cry蛋白可供使用,是Bt及其Cry蛋白长期应用的两大制约。为此,本研究解析了53个Cry8蛋白的空间结构,解析了其空间结构差异,阐明了Cry8与其受体之间的结合情况,探讨了其构效关系。主要结果如下:本文利用同源建模的方法构建了53个Cry8蛋白的三维结构模型。基于活性区二级结构的差异将其分为34类,分别为Cry8AⅠ-Ⅳ、Cry8BⅠ-Ⅲ、Cry8CⅠ-Ⅱ、Cry8DⅠ-Ⅱ、Cry8EⅠ、Cry8FⅠ-Ⅱ、Cry8GⅠ-Ⅱ、Cry8HⅠ、Cry8IⅠ-Ⅴ、Cry8JⅠ、Cry8KⅠ-Ⅲ、Cry8LⅠ、Cry8MⅠ、Cry8NⅠ、Cry8PⅠ-Ⅱ、Cry8Q?、Cry8RⅠ、Cry8TⅠ。在上述分类依据基础上,通过比对同一类别中各成员在三维结构上的重叠程度,将Cry8EⅠ类进一步分成两种亚型,即Cry8EⅠ1型(Cry8Ea2、Cry8Ea4、Cry8Ea5)和Cry8EⅠ2型(Cry8Ea1)。同理,分别又依次将Cry8FⅡ类分成为Cry8FⅡ1型(Cry8Fa2)和Cry8FⅡ2型(Cry8Fa3),Cry8IⅠ类分成Cry8IⅠ1型(Cry8Ia1)、Cry8 IⅠ2型(Cry8Ia2)和Cry8 IⅠ3型(Cry8Ia3),Cry8MⅠ类分成为Cry8MⅠ1型(Cry8Ma1、Cry8Ma3)和Cry8MⅠ2型(Cry8Ma2)。在解析53个Cry8蛋白的空间结构差异基础上,结合现有报道的Cry8蛋白杀虫活性数据,选取针对同一害虫存在杀虫活性差异以及具有相同杀虫活性的Cry8蛋白进行结构解析,探索其结构和活性的关系,得出以下结果:1、Cry8Bb1和Cry8Bc1对马铃薯甲虫、十一星黄瓜甲虫和西方玉米根叶甲虫都具有活性,两者具有相同的Loop-α8构象;2、Cry8Ca1和Cry8Ca2对铜绿丽金龟子都具有活性,两者具有完全相同的Loop构象;3、Cry8Da1和Cry8Db1对日本甲虫的成虫和幼虫都具有活性,但Cry8Da1的活性更强,两者的Loop-α8构象相同,但Loopα3-α4的构象存在差异,推测是N23S和Y44C两个位点上的差异造成的构象差异,从而导致Cry8Da1的活性更强;4、Cry8Ea1和Cry8Ea2对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟幼虫都有活性,两者具有完全相同的Loop-α8、Loop1和Loop3构象;5、Cry8Fa1对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟幼虫都有活性,Cry8Fa2却都无活性,两者Loop的构象都不同,推测是D448N的差异造成的;6、Cry8Ga1华北大黑鳃金龟有活性,而Cry8Ga2则无活性,两者的Loop3构象不同,推测是V337M的差异造成的;7、Cry8Ea1与Cry8Ga1对华北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟幼虫和铜绿丽金龟子有活性,对小菜蛾、棉铃虫、大黄粉虫和赤拟谷盗都没有活性,两者的Loop-α8和Loop3构象相同。以上的比对都提示了Loop对Cry8蛋白与害虫受体结合的重要性,尤其是Loop-α8,而Loopα3-α4的构象差异可能对杀虫活性强弱产生影响。此外上述事实均佐证了本研究建立的新的分类方式具有一定的合理性。将Cry8Ea1、APN和β微管蛋白两两对接,结果显示三者的重叠位点位于Cry8Ea1的Domain III上,共十个位点,分别为267E、464-465AN、477S、479N、573-577VGGSV,这显示了β微管蛋白可能影响了Cry8Ea1与暗黑鳃金鱼受体APN的结合,对其抗虫作用产生影响。然后将Cry8Ea1、凝集素和APN两两对接,结果显示Cry8Ea1与两者均能对接,但没有重叠位点,这预示着暗黑鳃金鱼凝集素可能与APN不存在竞争关系,因此凝集素可能不干扰Cry8Ea1的杀虫活性。最后,Cry8Ea1和Cry8Ea2分别与暗黑鳃金鱼膜丙氨肽酶的分子对接,结果显示:Cry8Ea1和Cry8Ea2与该受体结合的区域均为Loop-α8上的273-275GKH,这与两个蛋白结构比对的结果Loop-α8构象相同相一致,因此推断了Loop-α8对Cry8Ea1和Cry8Ea2与暗黑鳃金龟幼虫受体的特异性结合具有重要作用。Cry8Ea1和Cry8Ea2分别与APN对接,结果显示两种蛋白与暗黑鳃金鱼APN的对接区域为Loopα4-α5上的125-129VTGYE,这与两蛋白结构比对的结果Loopα4-α5构象相同相一致,因此推断了Loopα4-α5对暗黑鳃金龟幼虫的孔道形成有重要的作用。综上所述,本研究构建基于活性区空间结构的新分类方法,此分类方法比以往的根据杀虫谱和氨基酸序列同源性的分类方法更有利于探究空间结构和杀虫活性之间的关系,创建了苏云金芽胞杆菌蛋白结构与杀虫活性之间的新型关系,结合空间结构差异探讨了构效关系,利用分子对接技术探寻受体与Cry毒素结合区域的共同关键氨基酸结合位点,为今后各种突变体设计和克隆提供理论基础,对扩大Cry8型伴孢晶体蛋白的杀虫谱、提高其杀虫毒力、延缓害虫产生抗药性等具有重要意义。