禽兽抗生素的广泛使用,导致细菌耐药性、药物残留等一系列问题的出现,严重威胁到食品的质量与安全和人类的健康,是重要的卫生学问题。因此,聚焦抑菌和杀菌功能,研制新型绿色抗生素替代品成为目前迫切需要解决的问题。猪β-防御素-1(PBD-1)具有广泛的生物学活性、特殊的抗菌机制、不易产生药物残留及耐药性等优点,被认为是当前的绿色抗生素替代品之一。但猪β-防御素-1(PBD-1)存在表达量低,提取困难等缺点,并不能满足需求。利用基因工程的方法获得重组防御素已成为主要的方法之一。重组防御素直接口服后易被动物胃肠道的各种酶类降解,难以发挥其功能,微胶囊技术可将重组防御素包被起来,最大限度的保护其生物学活性及生物利用度,也为蛋白类药物的口服给药提供新的参考。因此,本研究通过体外构建大肠杆菌表达系统以获得具有生物学活性的重组PBD-1,并将其用海藻酸钠制备成微胶囊,为防御素的口服给药途径提供参考,具体研究内容结果如下:1.重组猪β-防御素-1(PBD-1)载体的构建及蛋白的表达与纯化通过Genbank获得猪β-防御素-1(PBD-1)成熟肽基因序列,根据大肠杆菌密码子的偏好性,优化PBD-1的基因序列,构建p ET-32a-PBD-1重组表达载体,并将其转化至E.coli BL21(DE3)p Lys S感受态细胞中,诱导重组蛋白的表达,利用SDS-PAGE及Western blot对表达的蛋白进行验证,结果显示,成功构建p ET-32a-PBD-1重组表达载体,经诱导后获得大小为24.5 k D左右的重组蛋白PBD-1。利用镍柱将重组蛋白进行亲和纯化,经BCA蛋白浓度测定试剂盒测得纯化后的重组蛋白的浓度为320μg/m L。2.重组猪β-防御素-1(PBD-1)的体外抑菌活性评价采用琼脂孔穴扩散方法对纯化后的重组蛋白进行体外抑菌活性评价,结果显示,重组PBD-1对大肠杆菌CMCC 44102的抑菌圈直径为19.17±0.57 mm、对金黄色葡萄球菌ATCC 25923的抑菌圈直径为28.47±1.28 mm、对沙门氏菌ATCC 9150的抑菌圈直径为21.97±0.98 mm、对肠道外致病性大肠杆菌S5的抑菌直径为21.99±0.94 mm、对肠道内致病性大肠杆菌S10的抑菌圈直径为24.91±0.76 mm、对肠道内致病性大肠杆菌S12的抑菌圈直径为27.45±0.88 mm。同时,微量抑菌试验结果显示:重组PBD-1对大肠杆菌CMCC 44102、沙门氏菌ATCC 9150、金黄色葡萄球菌ATCC 25923均具有抑制作用,对大肠杆菌CMCC 44102的最小抑菌浓度为80μg/L,对沙门氏菌ATCC9150和金黄色葡萄球菌ATCC 25923的最小抑菌浓度均为40μg/L。3.重组猪β-防御素-1(PBD-1)微胶囊的制备及体外释放特征的初步研究以海藻酸钠为壁材,纯化后的重组PBD-1为芯材,采用凝聚法,制备微胶囊。以微胶囊的径粒、圆整度及包埋率为指标,成功制备微胶囊。优化制备条件,并对制备的微胶囊进行体外释放特征的初步研究。结果显示,当海藻酸钠浓度为1.5%,氯化钙浓度为1.5%时,制备的微胶囊圆整度较好,直径约为1.1±0.11 mm,包埋率为75.19%。制备的微胶囊在模拟胃液中较为稳定,5 h时释放量约为15%;在模拟肠液中快速、大量释放,5 h时释放量即达到96%左右。结果表明,重组PBD-1微胶囊可抵抗胃液的破坏作用且具有良好的肠溶性。综上,本研究以体外构建猪β-防御素-1(PBD-1)载体及蛋白的表达和纯化为研究导向,成功构建p ET-32a-PBD-1重组表达载体,并将其转化至E.coli BL21(DE3)p Lys S感受态细胞中诱导重组蛋白的表达,获得生物活性PBD-1,并将其成功制备为微胶囊,为其后期产业化应用奠定了基础研究。