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背景与理论依据胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,约占颅内恶性肿瘤的80%。由于其侵袭性强、复发时间短、预后差,严重威胁着患者的生存时间和质量。近年来,大量的研究揭示了恶性胶质瘤的分子分型,肿瘤发生、侵袭、复发以及部分耐药的机制,然而胶质瘤作为异质性肿瘤,组织微环境中的神经干细胞、小胶质细胞细胞、内皮细胞等微环境细胞与肿瘤细胞相互作用亦是肿瘤发生、侵袭和复发的重要原因。肿瘤微环境中的巨噬细胞被称为肿瘤相关小胶质细胞(Tumor associated microglia,TAMs),这些浸润到肿瘤中的TAMs受到肿瘤细胞及微环境调控,同时TAMs又通过分泌各种细胞因子、趋化因子参与肿瘤的基质重塑、免疫抑制和血管形成,与肿瘤生长、侵袭以及放化疗的耐受有着紧密的联系。多项研究表明胶质瘤组织中TAMs是最主要浸润的炎性细胞(可达到肿瘤组织的30%),其浸润程度与胶质瘤的分级及预后呈明显的相关性,表明了TAMs在胶质瘤发生发展中发挥了重要促进作用。胶质瘤中的TAMs有着强大的可塑性及多样性,小胶质细胞和巨噬细胞在不同的细胞因子、炎症因子和趋化因子的作用之下活化,呈现出不同的极性.。研究表明,恶性胶质瘤中的TAMs通过表达TGF-β,MT1-MMP,MMP9,VEGF,Arg1等经典M2型标记物促进肿瘤侵袭及血管形成,因此许多学者将TAMs定义为M2型小胶质细胞即选择活化型小胶质细胞。探寻恶性胶质瘤调控TAMs极化的机制,寻找逆转其促肿瘤表型的靶点及相关药物,可能成为恶性胶质瘤辅助治疗的一种新思路。然而目前胶质瘤中TAMs极化的调控机制尚不完全清楚,其中关键分子还需进一步研究与发现。水通道蛋白1(AQP1)是一种小疏水跨膜整合蛋白,其在水分子的跨膜转运中具有主导作用。以往认为AQP1的作用单纯为易化水转运,最近的研究发现AQP1的表达与许多类型的肿瘤的临床特征都有紧密的联系,甚至可以是某些肿瘤如结肠癌预后的独立预测指标。在颅内胶质瘤方面,AQP1被发现在胶质瘤内有高度表达,有意思的是,其在周边的表达量明显高于肿瘤内部。AQP1参与到细胞不仅仅是肿瘤细胞还有微环境细胞的迁移,血管形成,形态改变。已有研究证实AQP1参与巨噬细胞的极化转变,而且对于小胶质细胞这种形变能力很强的细胞而言,其功能被发现受其形态的改变所直接调控,那么AQP1是否对于小胶质细胞的极化特性和迁移能力是否有影响,其对于TAMs的促进肿瘤发生发展的能力是否有推动作用?本研究旨在研究小胶质细胞上AQP1的功能,进而探讨其在胶质瘤发展过程中所起的作用。方法:第一部分:分离原代小胶质细胞,并合成转染AQP1 siRNA到小胶质细胞系BV2上,鉴定其效率为下面的实验提供工具。第二部分:首先比较野生型和AQP1敲除型小胶质细胞的形态,鉴别出AQP1对于小胶质细胞形态的影响。然后将分离的野生型小胶质细胞和AQP1基因敲除小胶质细胞用Real-time PCR和Western blotting检测极化相关基因(Arg1,IL6,IGF-1,CD206等)、蛋白(Arg1,iNOS等)的表达差异,从而分析出AQP1对于小胶质细胞的极化调控。第三部分:首先将人正常脑组织和人胶质瘤标本中的小胶质细胞都用IBA1,AQP1免疫荧光的方法分析出胶质瘤中TAMs的AQP1表达改变;然后构建小鼠GL261肿瘤模型,同样用IBA1,AQP1免疫荧光的方法分析出胶质瘤中TAMs的AQP1表达改变。接着用U87,U251,U373,SW1088,GL261的胶质瘤条件培养基刺激小胶质细胞,用Western Blotting确认TAMs的AQP1表达改变,同时用Real-time PCR检测AQP1,AQP3,AQP4,AQP9的表达改变。然后用野生型及AQP1敲除型小胶质细胞的条件培养基刺激GL261小鼠胶质瘤细胞系,测定其迁移能力和增殖能力的改变并用Western Blotting检测其AQP1和MMP9的改变,再用AQP1 siRNA的方法来鉴定AQP1改变对于胶质瘤的意义。最后对比野生型和AQP1敲除型小鼠的GL261胶质瘤模型的载瘤小鼠生存期,体内实验的方法对前面体外实验的确认与补充,证明肿瘤微环境中小胶质细胞上AQP1对于肿瘤发生发展的影响。实验结果1.AQP1 siRNA转染效率高,细胞免疫荧光鉴定发现50nmol和75nmol AQP1si RNA组荧光强度明显低于阴性对照组)。Western Blotting鉴定发现50nmol si RNA组和75nmol siRNA组的AQP1表达量下降很明显。2.AQP1敲除小胶质细胞与IL4刺激组小胶质细胞(M2型小胶质细胞)形态类似,都表现为长突触的形态。当用50nmol的AQP si RNA沉默BV2细胞后,Transwell实验、划痕实验结果发现其迁移能力明显提高。对野生型和AQP1敲除型小胶质细胞极化相关基因的Real-time PCR的结果分析发现相较于野生型,AQP1敲除型小胶质细胞表达更多的M2(Arg1,CD206,MMP9)型指标,较少的M1(iNOS,IL6)型指标和极少的AQP1和VEGF。AQP si RNA沉默BV2细胞后,Western Blotting发现iNOS表达明显下降表达明显增加。3.相较于人正常脑组织中的小胶质细胞(IBA1阳性细胞),胶质瘤标本内小胶质细胞表达AQP1的荧光强度明显降低。相较于小鼠正常脑组织中的小胶质细胞(IBA1阳性细胞),胶质瘤标本内小胶质细胞表达AQP1的荧光强度明显降低。相较于野生型小胶质细胞条件培养基的刺激(WTCM),AQP1敲除的小胶质细胞条件培养基(AQP1KO CM)刺激胶质瘤能够显著提高胶质瘤的迁移能力。WTCM和AQP1KOCM都能增加胶质瘤细胞的增殖能力,但是AQP1KOCM与WTCM之间作用差异不明显。用50nmol和75nmol AQP1siRNA沉默小胶质细胞后的条件培养基(50nM siCM和75nM siCM)刺激胶质瘤能明显上调其AQP1和MMP9的表达。沉默胶质瘤细胞上AQP1发现,沉默AQP1能够显著降低胶质瘤细胞的迁移能力。AQP1基因敲除型小鼠种入肿瘤后平均生存期较野生型载瘤小鼠短,但是两组间差异不具有统计学意义(P=0.0874)。结论AQP1表达降低能够使小胶质细胞从形态和功能上向M2型小胶质细胞极化,并且增加小胶质细胞的迁移能力。胶质瘤能够驯化小胶质细胞使其AQP1表达下降从而极化成促肿瘤的TAMs并反过来促进肿瘤细胞的侵袭与迁移,最终促进胶质瘤的发生发展。