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子宫内膜癌是女性生殖道常见三大恶性肿瘤之一,近年来其发病率居高不下,且病死率呈上升趋势。子宫内膜癌的发生发展是内外多种因素相互作用的结果,长期雌激素刺激是其主要危险因素。研究表明,在子宫内膜癌的发生和发展中存在DNA甲基化异常,低甲基化是肿瘤发生过程中的早期的表观遗传学改变。SF-1基因是雌激素生物合成重要的转录因子,能够激活胆固醇迁移和类固醇生成所涉及的基因表达,在类固醇激素的生物合成过程中发挥着关键作用。那么SF-1基因是否在子宫内膜癌发生发展中发挥作用并受到甲基化调控?这种作用又是通过何种分子机制来实现的?因此本研究首先在组织水平检测子宫内膜癌SF-1表达及其基因启动子甲基化状态；然后通过细胞学实验,探讨SF-1基因甲基化异常对子宫内膜癌生物学行为的影响及其分子机制,将从新的分子靶点探寻子宫内膜癌的生物学标志物,为子宫内膜癌的有效诊治策略提供可借鉴的实验依据。第一部分子宫内膜癌组织中SF-1基因启动子甲基化状态及其临床意义目的检测子宫内膜癌组织、癌旁组织和正常子宫内膜组织中SF-1蛋白和甲基化相关蛋白DNMTs的表达以及SF-1基因启动子的甲基化状态,探讨子宫内膜癌组织中SF-1基因启动子区甲基化状态与子宫内膜癌临床病理特征之间的关系。方法1.采用免疫组织化学方法,检测正常子宫内膜组织、子宫内膜癌及癌旁组织中SF-1蛋白的表达情况。2.采用western blot方法,检测正常子宫内膜组织、子宫内膜癌及癌旁组织中SF-1蛋白和DNMTs蛋白的表达水平。3.分析子宫内膜癌组织中,SF-1蛋白表达水平与临床病理特征的关系。4.采用BSP方法,检测子宫内膜癌及癌旁组织中SF-1基因启动子区甲基化状态。结果1.IHC显示,子宫内膜癌组织中SF-1蛋白表达明显高于正常子宫内膜组织,差异有统计学意义(P<0.05)；且同一病例中子宫内膜癌组织SF-1表达显著高于子宫内膜癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.WB结果显示,在子宫内膜癌组织中,SF-1蛋白呈高表达,和癌旁组织比较,差异有显著性(P<0.05),和正常内膜组织比较,差异有极显著性(P<0.01)。甲基化相关蛋白DNMT3a和DNMT3b在子宫内膜癌组织中的表达明显低于子宫内膜癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。3.在不同病理类型、不同病理分级的子宫内膜癌中,SF-1蛋白的表达水平不同,差异有统计学意义(P<0.05)。肿瘤组织病理分级越高,其SF-1表达水平越高；特殊类型子宫内膜癌中SF-1表达明显高于子宫内膜样腺癌。4.BSP结果显示,甲基化胞嘧啶百分比在子宫内膜癌组织(8.2%)明显低于癌旁组织(40.9%),差异有统计学意义(P<0.05),表明SF-1基因启动子在子宫内膜癌组织呈低甲基化状态。结论1.SF-1在子宫内膜癌的发生发展过程中可能起促进作用,其异常高表达与患者的不良预后有关。2.SF-1基因启动子区的异常低甲基化可能是其蛋白表达水平升高的原因,SF-1基因启动子低甲基化状态在子宫内膜癌发生发展的分子机制中可能起着重要的作用。第二部分SF-1基因启动子甲基化异常对子宫内膜癌细胞生长的影响目的利用DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-2’-deoxycytidine (5-Aza-CdR)处理子宫内膜癌细胞后,使SF-1去甲基化,研究SF-1基因启动子甲基化异常对子宫内膜癌细胞SF-1表达及生物学行为的影响。方法1.以子宫内膜癌细胞株HEC-1-A, RL95-2为研究对象,分别加以不同浓度的甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR,每种细胞系分成不同浓度的5-Aza-CdR组和未经任何处理的对照组。2.采用EdU荧光标记法测定不同浓度5-Aza-Cd R组处理后的细胞增殖情况。3. Western blot方法检测不同浓度5-Aza-CdR组和对照组细胞中SF-1表达的差异。4.BSP法检测5-Aza-CdR处理后细胞SF-1基因启动子甲基化水平。5.采用qPCR法检钡5-Aza-CdR处理细胞后SF-1下游靶基因StAR, HSD3β2和CYP19A1 mRNA的表达。6.通过流式细胞仪检测5-Aza-CdR组和对照组细胞凋亡的情况,以及采用Western blot方法检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3和细胞周期蛋白Cyclin D3的表达。结果1.根据EdU检测细胞增殖结果,低浓度5-Aza-CdR对子宫内膜癌细胞有促进增殖作用,高浓度5-Aza-CdR对细胞产生毒性,抑制细胞增殖(P<0.05)。2. Western blot结果显示,在子宫内膜癌细胞株HEC-1-A和RL95-2中,SF-1蛋白呈一定水平的表达,经过5-Aza-CdR处理后两种细胞株均表现为SF-1表达升高,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。3.BSP测序结果显示,低浓度5-Aza-CdR明显降低SF-1基因启动子区CpG位点甲基化水平(P<0.05)。4.通过实时荧光定量PCR发现,5-Aza-CdR处理后SF-1下游靶基因StAR, HSD3β2和CYP19A1 mRNA的表达明显增高(P<0.05)5.流式细胞仪检测细胞凋亡的结果显示：与对照组相比,低浓度5-Aza-CdR组细胞凋亡明显减少,高浓度5-Aza-CdR组细胞凋亡明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。6.细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达检测发现,1.0uM 5-Aza-CdR处理后细胞Bcl-2表达明显增加,Bcl-2/Bax比值增加,或Caspase-3表达明显降低(P<0.05)；5.0uM 5-Aza-CdR处理后Bax表达极显著升高(P<0.01),或Bcl-2表达明显降低,Bcl-2/Bax比值下降,Caspase-3表达明显升高(P<0.05)。7.细胞周期蛋白Cyclin D3的表达检测显示,1.0 uM和2.5 uM的5-Aza-CdR作用后,细胞HEC-1-A和RL95-24中Cyclin D3的表达均明显增加(P<0.05)。结论1.通过5-Aza-CdR抑制SF-1基因启动子甲基化水平后,能促进子宫内膜癌细胞SF-1表达,说明子宫内膜癌细胞SF-1高表达与SF-1基因启动子区去甲基化有关。2.SF-1去甲基化,表达上调后,其下游靶基因表达增加,子宫内膜癌细胞的增殖能力增强,细胞凋亡受到抑制,说明SF-1基因在子宫内膜癌中具有癌基因的特点。3.SF-1基因在子宫内膜癌发生发展中可能发挥重要作用,SF-1甲基化水平可能成为预测内膜癌增殖能力的新的分子靶点。