第一部分Hfq参与鼠疫菌致病的分子调控机制研究背景:鼠疫是一种自然疫源性疾病,其病原体是鼠疫耶尔森菌(以下简称鼠疫菌)。鼠疫是一种人兽共患病,在自然界中主要以蚤类为传播媒介寄居在特定的宿主(啮齿动物)内,引起鼠疫的周期性爆发,通过偶然与患畜接触或被带菌跳蚤叮咬进入人体,由皮下途径感染,随后进入血液循环系统,在淋巴结部位引发腺鼠疫,如果未加控制,最后将发展成为致命的肺鼠疫和败血症鼠疫。在这个过程中,有多种机制帮助鼠疫菌完成蚤体内生存、形成菌栓、在宿主体内黏附、侵袭、抗吞噬以及宿主细胞毒性等功能。鼠疫菌传播过程和多宿主生活周期,决定了鼠疫菌必须存在多种适应宿主机制最终才能得以生存,并能在宿主间传播以至最终致病。细菌中除了蛋白类的调控因子之外,还存在着一些发挥调控作用的非编码RNA(non-coding RNA),即调控sRNA(regulatory small RNA)。这些调节sRNA,它们在转录后通常并不翻译为蛋白质,广泛存在于各种生物体中,在多种细胞过程中发挥调控作用。sRNA在转录起始、延伸、终止、mRNA稳定性以及mRNA翻译等环节上对靶基因进行调控,在染色体转录与失活、基因表达与关闭、细胞周期乃至个体发育等过程中均具有重要的作用,很可能对生物体的复杂性也起决定作用。其调节作用机制主要是利用序列互补或形成特定的“茎环结构”(stem-loop)。在细菌中,sRNA和蛋白类调控因子紧密协同,通过调节细胞生理过程来适应外界环境的变化。蛋白协同因子在sRNA和其靶mRNA配对结合的过程中具有重要作用。细菌sRNA与靶RNA的配对大都需要RNA伴侣分子Hfq蛋白的参与。Hfq是一种RNA结合蛋白,被认为是细菌基因转录后的关键调控因子。Hfq是高度保守的耐热蛋白,在体内通常形成环状六聚体,与真核生物RNA剪接中的Sm和Sm样蛋白同源。目前Hfq参与相关sRNA调控功能的研究已有很多,但Hfq在病原细菌中的作用及其相关机制仍不清楚。结合其他病原菌Hfq研究现状和鼠疫菌自身特点,我们推测:鼠疫菌Hfq蛋白可能通过sRNA发挥调节功能,影响到鼠疫菌毒力基因的表达调节,最终影响到鼠疫菌的致病过程。然而,尚未见到关于鼠疫菌Hfq蛋白与鼠疫菌致病相关的任何报道。本课题旨在探讨鼠疫菌Hfq蛋白与鼠疫菌抗吞噬和致病的关系,并探讨其可能的分子调控机制。方法:采用基于λ-Red重组系统的基因突变技术,以Km~R(卡那抗性盒)替代鼠疫菌hfq基因,构建鼠疫菌?hfq缺失突变株( hfq::Km~R),并同时构建其互补株(201Δhfq::Km~R/pACYC-hfq)。目前认为巨噬细胞内生存和繁殖是鼠疫菌感染机体早期的关键环节。而巨噬细胞涉及多个环境胁迫因素,如引发细菌热休克反应、过氧化物、高渗、抗菌肽和营养缺乏等。根据上述鼠疫菌可能面临的胁迫环境,我们确定了表型研究的主要内容。利用体外生长和存活实验,比较上述对数中期的两株菌对短期刺激(如热、氧化胁迫)和长期刺激(如高盐、抗菌肽和营养缺乏)的敏感性。Hfq蛋白很可能与鼠疫菌抗吞噬和细胞内存活能力密切相关,因此,我们设计细胞感染实验来验证这一想法。鼠疫菌感染鼠巨噬细胞系J774A.1后,观察鼠疫菌野生株和?hfq突变株侵染能力和引起巨噬细胞毒性的病理学变化,比较其吞噬率和不同时间存活率的差异。为研究Hfq在鼠疫菌毒力及致病性过程中的作用,我们比较野生株和突变株的毒力变化,鼠疫菌野生株和?hfq突变株以不同途径(静脉或皮下)感染BalB/c小鼠,最终计算半数致死剂量(LD50);鼠疫菌野生株和突变株等量混合后,大剂量静脉感染小鼠,分析动物体内脏器的细菌分布情况,并计算竞争指数(competitive index, CI)。通过体外芯片转录谱进行Hfq蛋白的转录后调控分析,体外培养鼠疫菌野生株和Δhfq突变株,分别提取总RNA,经过双色荧光(Cy3-或Cy5)标记后,与鼠疫菌全基因组ORF芯片进行杂交(芯片转录谱分析),比较野生株和突变株各个对应基因转录水平的变化,在全基因组范围内鉴定转录上调和下调的基因(转录后水平)。最后汇总上述所有数据,探讨Hfq参与鼠疫菌致病的分子机制。结果:成功的构建了鼠疫菌hfq突变株及其互补株。缺失hfq基因的鼠疫菌除生长速度减慢外,对热、氧化剂、抗菌肽和营养缺乏的敏感性增加。缺失hfq基因后,鼠疫菌细胞相关细菌(cell-associated bacteria)没有明显改变,而吞噬率(phagocytosis percent)和早期存活率(survival percent)下降。缺失hfq基因的鼠疫菌毒力明显下降,同时突变株在小鼠脏器内的分布数量明显下降,证明Hfq蛋白控制着鼠疫菌毒力和体内生存力。缺失hfq基因引起了鼠疫菌243个共超过13类的基因转录水平变化。这些基因的功能涉及到小分子的降解,大分子的合成调控及降解、调控子、细胞被膜、致病性相关、转运/结合蛋白、能量代谢、质粒源的蛋白等。其中56个基因(约23%)的基因可能参与鼠疫菌毒力或环境适应反应。结论:Hfq在鼠疫菌对抗热、氧化压力、营养缺乏以及抗菌肽的过程中有重要作用,但是在鼠疫菌对高盐(高渗)的耐受中则不是必须的。提示Hfq可能参与鼠疫菌抵抗多种体外胁迫条件(热、氧化应激、抗菌肽、营养缺乏等),这些体外条件与巨噬细胞内微环境吻合。因此,Hfq在鼠疫菌侵染巨噬细胞过程中可能起到重要作用。我们的细胞感染实验结果也证实:Hfq蛋白可能与鼠疫菌抗吞噬和细胞内存活能力密切相关, Hfq可能通过调控下游基因的表达,调节鼠疫菌抗吞噬和胞内存活特性。同时Hfq对于鼠疫菌致病性至关重要,对鼠疫菌的毒力以及在小鼠体内生长和繁殖过程是必不可少的。?hfq突变株与野生株相比共有243个基因发生转录水平的变化,其中有23%的基因可能与鼠疫菌应激或毒力相关。这表明Hfq可能参与鼠疫菌多种生理及致病相关过程。汇总上述所有数据并总结现有研究结果的基础上,我们提出了Hfq参与鼠疫菌致病可能的分子机制,即Hfq通过与sRNA相互作用,调节应激蛋白和毒力因子的表达,参与鼠疫菌的体外应激、抗吞噬和致病过程。第二部分KatA和KatY在鼠疫菌抗氧化过程中的作用及其调控研究背景:鼠疫菌是鼠疫的病原菌,在其感染机体早期是一种兼性胞内致病菌。鼠疫菌在蚤体内和哺乳动物体内传播,通过带菌跳蚤的叮咬,或是与染菌动物等接触进入人体。当鼠疫菌进入宿主后,首先被局部淋巴组织中的吞噬细胞(包括多形核白细胞PMNs和巨噬细胞)吞噬。单核细胞中的鼠疫菌被杀死,而被巨噬细胞吞噬的鼠疫菌则在巨噬细胞中可以存活和繁殖。吞噬细胞产生的过氧化氢是在鼠疫释放至细胞外之前主要的胁迫因素。所以,鼠疫菌可能具有严格的适应抵御氧化压力的机制以应对过氧化氢介导的杀菌作用。鼠疫菌具有较高的氧化抗性,但其抗氧化机制目前还不清楚。KatY在鼠疫菌中作为一种温度依赖性抗原被发现。假结核耶尔森菌中也有KatY在低钙响应中表达,但是小肠结肠炎耶尔森菌中则没有发现KatY的存在。根据基因组注释信息,鼠疫菌的katA基因和katY基因都编码过氧化氢酶/过氧化物酶。从芯片转录谱分析的结果看,上述两个基因的转录均受到体外低浓度H2O2的诱导,katA和katY基因转录水平增加的倍数分别是2.5倍和3.2倍。结合OxyR的调控元分析,我们认为上述两个基因很可能是OxyR的靶标基因。与此同时,芯片杂交的结果还显示,基因katA和katY均受温度调控,但二者调节方向却是相反的。鼠疫菌培养温度由26°C上升到37°C时,基因katY转录水平上调,而katA基因转录水平发生下调。据此我们推测在不同培养温度下的鼠疫菌对H2O2的敏感性可能不同。经过序列比对,确定KatY是一个过氧化氢-过氧化物酶。katY基因与鼠疫菌编码呼吸细胞色素的基因cybB及cybC相连,且其启动子共用一个pCD1编码温度感应转录激活子LcrF的一致识别序列。缺失pCD1质粒的突变株中KatY的活性依然具有温度依赖性,所以显然KatY不仅受LcrF的调控。由于KatY具有分解巨噬细胞产生的过氧化氢的能力而且具有温度依赖性,推测它是一个重要的毒力因子。但是仍然不清楚的是过氧化氢酶是如何参与鼠疫菌生理和致病过程的。本课题在研究KatA及KatY在鼠疫菌抗氧化机制中作用的同时进行其调控因素的研究。研究鼠疫菌表达过氧化物酶/过氧化氢酶在鼠疫菌抗氧化过程的作用,及其调控因素,对于研究鼠疫菌抗氧化机制具有重要意义,为研究鼠疫菌胞内存活机制提供依据。方法:采用基于λ-Red重组系统的基因突变技术,以抗性盒替代鼠疫菌katA、katY基因,构建鼠疫菌ΔkatA、ΔkatY、ΔoxyR缺失突变株以及ΔoxyR-ΔkatA、ΔoxyR-ΔkatY双突变株,并同时构建其互补株。此外,构建在无触酶活性的大肠杆菌UM255株中的KatA和KatY蛋白表达菌株。通过凝胶染色实验以及过氧化氢酶/过氧化物酶活性直接测定来确定KatA和KatY的酶活性。随后,利用H2O2抗性纸片实验研究KatA及KatY在鼠疫菌体外抗氧化过程中的作用。最后通过一系列不同条件下的lacZ报告基因融合实验研究katA和katY的转录调控方式,以及分子生化实验验证OxyR对katA和katY的调控。结果:成功的构建了ΔkatA、ΔkatY、ΔoxyR缺失突变株以及ΔkatA-ΔkatY、ΔoxyR-ΔkatA、ΔoxyR-ΔkatY双突变株,及其互补株。成功表达并纯化了KatA和KatY蛋白。凝胶染色实验以及过氧化氢酶/过氧化物酶活性直接测定显示,KatA是一个单功能的过氧化氢酶,而KatY是过氧化氢酶/过氧化物酶。鼠疫菌的野生株在对数中期对H2O2具有高度抗性,与野生株相比在对数早期katY突变株对H2O2更加敏感。在对数中期, katY突变株与野生株对H2O2的抗性基本相同。鼠疫菌201野生株中β-半乳糖苷酶活性与?oxyR突变株相比,超过3倍,表明鼠疫菌OxyR可能由生长过程中产生的外源过氧化氢刺激而激活。证明katA和katY均受OxyR的调控。与26°C相比,37°C时鼠疫菌katY基因转录水平增加,而katA转录水平无显著变化,提示katY基因的转录受到温度的调节。鼠疫菌oxyR突变株在26℃生长时katA启动子活性在不同时期显示出明显的变化。在静止期katA启动子活性最高。然而katY启动子活性在同样的条件下并没有发生明显的改变。被巨噬细胞吞噬后,与0时间点相比katY启动子的活性在5小时时增加约69倍,在2小时时增加约6倍。而katA启动子的表达则没有这样的变化。EMSA实验结果显示OxyR与katA及katY基因启动子区均发生结合。DNase I足迹实验结果显示OxyR与katY转录起始位点上游68-110bp以及katA转录起始位点上游151-186bp处结合。结论:我们的实验证实了鼠疫菌KatA和KatY的催化性质与典型的过氧化氢酶相似。KatA是鼠疫菌在多种生长时期表达的主要过氧化氢酶。结果说明,KatA在鼠疫菌对抗过氧化氢刺激过程中具有主要的作用,与其他致病菌中对抗氧化杀伤的单功能过氧化氢酶相同。但是鼠疫菌KatY是一个双功能过氧化氢酶,可能不再发挥传统的生理作用。鼠疫菌KatA(HPII)和KatY(HPI)受过氧化反应调控子OxyR的调控,而大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌(S. typhimurium)中HPII则不受OxyR的调控。这说明OxyR的功能即使在相似的肠道菌属种也是不同的。但是OxyR在katA及katY中的DNA识别位点与大肠杆菌OxyR的DNA识别位点相似,说明在不同的菌中OxyR的调控机制是相似的。?oxyR突变株katY基因转录显示出温度依赖性表达,而KatA受到生长时期调控。KatA和KatY的调控应进一步研究。Garcia提出,LcrF不是KatY温度调控的唯一调控子。已知的RNA温度调控子位于特定的热休克或是毒力基因5’-非翻译区,通过与核糖体结合位点的温度依赖性碱基配对结合来调控翻译。katY的5’-非翻译区的二级结构经预测显示出具有ROSE样RNA温度计(RNA thermometer)相关性质。可能的RNA温度计是否对调控KatY翻译应进一步研究。鼠疫菌在宿主巨噬细胞内可以存活并增殖。鼠疫菌与宿主巨噬细胞件的相互作用可能是其致病性的关键。KatY受到温度及过氧化氢的调控,这是吞噬溶酶体内微环境的两个主要部分。细菌在胞内生长时KatY的水平升高,这说明鼠疫菌KatY可能在感染过程中巨噬细胞内的存活及生长中具有重要作用。