牛病毒性腹泻/粘膜病(bovine viral diarrhea，BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起，主要以腹泻、粘膜糜烂溃疡和持续性感染为特征的牛传染性疾病。牛病毒性腹泻病毒属于黄病毒科、瘟病毒属，感染此病毒的动物易出现免疫抑制，且目前尚无针对靶点的抗病毒药物，致使全球养牛业遭受着巨大的经济损失。近年来研究发现，MicroRNAs(miRNAs)作为内源性表达的非编码小RNA与病毒感染引起的炎症反应、免疫应答存在着密切的关系。研究发现，病毒感染动物导致其体内miRNA表达异常，部分miRNA被证实对病毒的侵袭及复制有抑制作用。相反，病毒亦可利用miRNA的变化使动物机体产生免疫抑制而阻碍免疫应答，对病毒起到保护作用。目前，BVDV利用何种受体进入机体，以及进入机体后的免疫应答机制、免疫抑制产生过程仍尚未研究清楚。本试验通过BVDV NADL(以下简称BVDV)感染导致MDBK细胞miRNA表达量发生变化，验证显著差异的基因，探索其在BVDV感染过程中发挥的作用，旨在为全面深入研究牛病毒性腹泻致病机理提供科学依据。
　　本试验对BVDV感染MDBK细胞后bta-miR-424-5p基因差异表达进行检测和鉴定。将MDBK细胞接种100TCID50BVDV，8h后利用RT-qPCR与Northern blot两种方法分别检测感染后的MDBK中bta-miR-424-5p表达量，用未感染BVDV的正常MDBK细胞作为对照，比较BVDV感染前后MDBK细胞中bta-miR-424-5p相对表达差异。结果显示，感染BVDV细胞中bta-miR-424-5p表达量显著高于未感染细胞中bta-miR-424-5p表达量(P＜0.05)，RT-qPCR检测与Northern blot检测均显示其表达差异倍数在2左右，证实BVDV感染引起MDBK细胞中bta-miR-424-5p表达量升高。
　　研究bta-miR-424-5p参与的生物反应，分析其成熟序列的保守性并预测靶基因，在DAVID6.7网站中对候选靶基因进行GO富集分析与KEGG富集分析。结果显示，bta-miR-424-5p成熟序列住各物种间高度保守，并预测到靶基因101个。靶基因分布在细胞质、质膜、高尔基体等细胞组分中，在蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、IkappaB激酶活性分子功能上高度富集，参与蛋白质氨基酸磷酸化、多细胞生物生长负调节和细胞增殖等生物学过程，在Toll样受体信号通路、细胞凋亡通路和MAPK信号通路中发挥作用。根据生物信息学分析，选取NF-κB经典通路中与免疫应答、炎症反应相关的靶基因IKBKB。对比发现，IKBKB基因3’UTR的第475-482位碱基与bta-miR-424-5p的种子区第2-8位碱基完全互补，可作为进一步研究的F1的靶基因。
　　通过双荧光素酶报告试验对bta-miR-424-5p与IKBKB基因的靶关系进行验征，将bta-miR-424-5p mimics、Inhibitor、NC分别转染到MDBK细胞中，通过RT-qPCR和Western blot分析IKBKB基因表达造的变化。结果显示，bta-miR-424-5p mimics显著降低荧光素酶相对活性。与NC组相比，mimics组细胞中IKBKB基因表达量显著降低(P＜0.05)，Inhibitor组中IKBKB基因表达苗显著上升(P＜0.01)。结果表明，bta-miR-424-5p靶向IKBKB基因，并有效抑制IKBKB基因的表达。将BVDV接种到转染bta-miR-424-5p mimics与bta-miR-424-5p NC的MDBK细胞中，检测IL-8、IL-1β、TNF-α、COX-2炎症因子与相关通路蛋白的表达情况。结果发现，与NC组相比，mimics组中炎性因子水平显著下降(P＜0.05)，相关通路蛋白p-p65与p-IκBα蛋白磷酸化水平显著下调(P＜0.05)。
　　本研究证实BVDV-1感染引起bta-miR-424-5p表达量显著上调，bta-miR-424-5p靶向抑制IKBKB基因阻碍NF-κB信号通路活化，调控细胞因子炎性反应的发生。