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目的:研究缺血后适应中蛋白激酶Cε (PKCε)与钙敏感受体(CaR)相互作用对乳鼠心肌细胞的保护作用。
方法:Wistar乳鼠(出生后3-7天)心肌细胞培养3-5天,随机分为七组:正常对照组(N组),缺氧/复氧组(I/R组),缺血后适应组(PC组): GdCI3组(GdCI3,NiC12,CdC12+PC组),CaR抑制剂组(GdCI3,NiC12,CdC12,NPS2390+PC组)和PKCI+GdCI3组(白屈菜红碱,GdCI3,NiC12,CdC12+PC组),ERK抑制剂组(PD98059,GdC13,NiC12,CdC12+PC组)。采用饱和氮气pH6.8的D-Hanks液和含20%新生牛血清的DMEM液复制心肌缺血后适应模型,即用pH6.8的D-Hanks液在缺氧培养箱(95% N2,5%C02,37℃)培养3小时,缺血缺氧3小时后把pH6.8D-Hanks换成含20%新生牛血清的DMEM液培养5分钟,然后再换成pH6.8D-Hanks液5分钟,如此三个循环后,在MCO-17AIC02培养箱(95%02,5%C02,37℃)复氧9小时。MTT比色法检测各组细胞存活率,对各组进行乳酸脱氢酶(LDH)活力和丙二醛(MDA)含量变化的测定,心肌细胞膜CaR和PKCε,细胞外信号调节激酶(ERK/MAPK)通路的蛋白表达水平Westernblot检测,激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)测定心肌细胞内游离钙([Ca2+]i)和线粒体内钙([Ca2+]m)的变化,Hoechst33342等染色观察细胞凋亡,JC-1染色观察线粒体膜电位势能的变化。
结果:I/R、GdCl3和PKCI组的MTT检测的细胞存活率和膜电位(JC-1)低于对照组和PC组:反之,LDH活力和MDA含量高于对照组和PC组。同时,在GdC13和PKCI+ GdCl3, ERKI+ GdC13组CaR的蛋白表达水平较PC组增高,且细胞内[Ca2+1、线粒体内[ca2+]、Hoechst33342柒色细胞凋亡结果也高于PC组;而在PKCI和PKCI+ GdCI3组PKCε的蛋白表达水平低于I/R、PC、GdCl3组。P-ERK在PC组和GdCl组蛋白表达量明显高于正常组。
结论:在乳鼠心肌细胞缺血后适应中,蛋白激酶C和钙敏感受体之间的相互作用对心肌具有保护作用,通过激活MAPK途径中的ERK信号转导通路来完成抑制细胞凋亡的作用。