糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一种危险因素多、发病机理复杂、病程伴随终身的慢性疾病。糖尿病患者具有动脉粥样硬化及血栓形成的危险因素,包括血脂异常、肥胖、高血压、高凝状态等,其巨大危害是导致各种严重的并发症。心脑血管事件是糖尿病最严重的并发症,也是影响患者生活质量和威胁患者生命的主要原因。近年来研究发现,糖尿病患者体内血小板处于活化状态,表现为血小板黏附、聚集及释放反应均增强,导致血管内凝血,血栓形成及动脉粥样硬化,在糖尿病血管病变的发病机制中起着重要作用。血小板膜的磷脂中含有花生四烯酸(arachidonic acid, AA),血小板细胞内有磷脂酶A2。当血小板表面被激活时,磷脂酶A2也被激活,从而使AA从质膜磷脂中分离出来,AA在环氧合酶-1(cyclooxygenase-1, COX-1)的作用下产生前列腺素G2、H2(Prostaglandin G2/H2, PGG2, PGH2),前列腺素G2、H2在血小板内血栓素合成酶的催化下可形成大量的血栓素A2(thromboxanl A2,TXA2),因此COX-1和血栓素合成酶是AA生成TXA2和PGH2等过程中的关键限速酶。TXA2是目前所知体内合成的最强的缩血管物质之一,同时XA2可抑制血小板膜上的腺苷环化酶,使环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)的生成减少,促进血小板活化、聚集,促进血栓形成。TXA2的半衰期极短,在体内经多种途径被迅速灭活,很快被降解为TXB2。测定TXA2可通过测定其稳定代谢产物,如血清或血浆中的血栓素B2或尿中11-脱氢血栓素B2。血清血栓素B2的含量在很大程度上依赖血小板COX-1,因此可用来衡量低剂量阿司匹林对血小板的抑制作用。已有许多实验证明,血小板内存在L-精氨酸(L-Arg)/一氧化氮(Nitric oxide,NO)系统,L-Arg在氧分子和血小板内一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)作用下,生成L-胍氨酸和NO,后者活化在鸟苷酸环化酶(Guanylate Cyclase,GC)的作用下使环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)水平升高,从而抑制血小板激活及聚集。在NO合成的过程中,NOS的活性是合成NO的重要限速步骤。NO能抑制血小板聚集功能,并使血小板活化减弱,减少脱颗粒及活性物质释放。研究表明,糖尿病患者体内存在血栓素A2(TXA2)释放增多,使血小板敏感性增加。血小板活性的增加不仅由于致凝物质的激活,还与抗凝机制抑制性作用丧失导致的血小板功能状态密切相关。研究发现,糖尿病患者血小板上内皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase, eNOS)活性明显低于正常人,说明eNOS活性在糖尿病心血管并发症的发生、发展中可能起着重要作用。在2型糖尿病中,阿司匹林可以进行有效的抗血小板活化治疗,对于预防糖尿病血管病变的发生、发展具有积极的临床意义。阿司匹林乙酰化血小板的COX-1阻止花生四烯酸转化为血栓素A2(TXA2),从而抑制TXA2的合成,阻断由TXA2诱导的血小板聚集和血栓形成,起到抗血小板作用。由于血小板是无核细胞,不能生成新的COX-1,所以阿司匹林抑制的COX-1的活性是不可逆的。研究显示,阿司匹林还能通过激活正常人的血小板eNOS的活性,增加NO的合成,抑制血小板聚集,发挥对血管内皮的保护作用。除了抗血小板聚集作用外,阿司匹林还可抑制炎性因子、过氧化物酶等,通过抗炎和抗氧化作用,间接起到抗血小板作用。在2型糖尿病患者中,虽然阿司匹林可以有效地抗血小板活化,预防心血管并发症的发生,但是阿司匹林抵抗(aspirin resistance, AR)的事件却常有发生。而胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)在2型糖尿病发病机制中占有核心地位。IR可引起氧化应激的增加,氧化应激可导致ox-LDL水平升高、核因子κB(NF-κ B)激活、内皮型NOS脱偶联,从而促进血小板粘附、聚集及血栓形成。IR增加自由基和活性氧的水平,后者反过来进一步损害胰岛素信号转导通路中代谢和血管性因素,促进血栓的形成。所以,我们猜测高胰岛素血症是否会通过阿司匹林抑制的COX途径,影响TXA2的合成；或者(并且)通过NOS及L-精氨酸转运两个限速环节,影响NO的生成。本研究在体外初步探索了胰岛素对阿司匹林抑制的血小板聚集率和TXA2的影响及对NO合成的影响。本研究在体外,用胰岛素干预阿司匹林作用的富血小板血浆(Platelet-rich plasma, PRP),通过血小板聚集仪、ELISA等方法检测,发现胰岛素增加了阿司匹林诱导的TXA2的合成,但是并没有改变NO的含量。材料与方法1、实验对象以本院健康志愿者新鲜静脉血来提取血小板。供血者入选条件：(1)无高血压、糖尿病、肾病、心脑血管疾病、血液病、肝病及传染病；(2)不吸烟；(3)近2周内未服用任何药物；(4)24小时内未曾饮酒；(5)前臂静脉暴露明显或较粗(前臂静脉主要指肘前静脉或头静脉,若纤细,由于采用较粗针头不易采血顺利)；(6)至少空腹12小时。2、实验方法2.1制备血小板血浆2.1.1采集静脉血室温在22℃-24℃下,由经培训的采血护士采血,选肘中静脉,以21G蝶形针头穿刺,将蝶形采血针的另一端连接采血管,先连接血常规管,之后再连接PT管,PT管中抗凝剂枸橼酸钠与全血体积比恒定为1：9。采血结束后,立即轻柔混匀。2.1.2制备富血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP)将离心机预温至21℃,以100×g相对离心力离心15分钟,以粗口一次性吸管小心吸取离心后的上清液,置于一洁净无菌离心管中。2.1.3制备乏血小板血浆(platelet-poor plasma, PPP)取已制备的部分PRP,继续以离心力2000×g,离心10分钟。以粗口一次性吸管吸取离心后的上清液,置于另一洁净无菌离心管中。2.1.3制备胰岛素-阿司匹林富含血小板血浆将制备的3组等体积的富含血小板血浆(PRP)分别加入30,100和300gU/mL的胰岛素,标记为A,B,C组,37℃的环境下孵育3min,再将上述每一组的PRP分成等体积的4个组,分别加入0,75,150和300μmol/L的阿司匹林,于37℃的环境下继续孵育30min。2.2检测血小板聚集率在血小板聚集仪中,用含有PPP的检测杯进行空白设置。将上述制备的PRP转移到检测杯中,加入25μL的ADP或AA,观察并记录5mmin内的血小板聚集过程。2.3检测血栓烷B2在血小板聚集率检测完毕后(即加入诱导剂5分钟),选择A组和C组的所有样本,均加入吲哚美辛和柠檬酸葡萄糖封闭血小板反应,每个样本离心8000g,2min。提取上清,保存在-80-C。可按照TXB2的ELISA试剂盒的检测说明书进行操作。2.4检测cGMP按照上述的方法提取富血小板血浆(PRP)。将其分成3组,分别加入L-NMMA、MB和缓冲液,均置于37℃水浴箱孵育20分钟。将上述各组等体积分成2份,分别加入30、300μU/mL胰岛素,置于37-C水浴箱孵育3min；继续向L-NMMA、MB组中分别加入300μmol/L的阿司匹林,而缓冲液对照组则再次分成等体积的2组,分别加入PBS缓冲液和300μmol/L的阿司匹林,以上所有小组均在37-C的环境下孵育30min。孵育后加入30%三氯乙酸终止反应,置于低温超速离心机中,以离心力2000×g,离心20min,去除沉淀的蛋白质。加入lmol/L盐酸,用乙醚除去三氯乙酸,10倍萃取上清液。将收集到的样品保存在-80℃。可按照cGMP的ELISA试剂盒的检测说明书进行操作。3、统计学处理采用SPSS13.0统计学软件分析数据。所有定量数据以x±s表示。两样本比较采用独立样本t检验,多组间比较方差时,采用两因素的方差分析,组间多重比较采用LSD-t检验,方差不齐时以Dunnett’s T3法行两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.血小板聚集率1.1ADP诱导血小板聚集率300μU/mL胰岛素浓度的富血小板血浆,在不同浓度阿司匹林0,75,150,和300μmol/L的孵育下,血小板最大聚集率为87.62±6.23%,60.85±16.24%,55.28±16.48%,49.36±±16.77%,显著高于相应30μU/mL胰岛素组的血小板最大聚集率84.644±8.09%,48.13±19.27%,44.30±±20.50%,35.30±±16.81%,其差异有统计学意义(P<0.05)；而胰岛素浓度300μU/mL组与100μU/mL组比较,胰岛素浓度30μU/mL组与胰岛素浓度100μU/mL组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。阿司匹林实验组(阿司匹林浓度为75,150和300μ mol/L组)可以显著抑制血小板聚集率(P<0.05),阿司匹林浓度300gmol/L组抑制血小板聚集率的效果最显著,但是小剂量阿司匹林,即阿司匹林浓度为150μmol/L组和阿司匹林浓度为300gmol/L组对血小板的抑制作用,差异无统计学意义(P>0.05)。1.2AA诱导血小板聚集率300μU/mL胰岛素浓度的富血小板血浆,在不同浓度阿司匹林0,5,30,和100μmol/L的孵育下,血小板最大聚集率为89.62±4.23%,88.03±6.93%,17.33±2.69%,13.77±2.76%均高于相应的100μU/mL的血小板最大聚集率89.43±4.88%,86.30±4.43%,10.10±2.34%,8.15±2.55%,和30μU/mL胰岛素组的血小板最大聚集率88.45±4.32%,86.56±5.18%,7.60±2.20%,4.56±2.15%,其差异有统计学意义(P<0.05)；而胰岛素浓度100μU/mL组与30pU/mL组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。阿司匹林实验组(阿司匹林浓度为5,30和100μmol/L组)可以显著抑制血小板聚集率(P<0.05),阿司匹林浓度100μmol/L组抑制血小板聚集率的效果最显著,但是小剂量阿司匹林,即阿司匹林浓度为30gmol/L组和阿司匹林浓度为100μmol/L组对血小板的抑制作用,差异无统计学意义(P>0.05)。2.TXB2合成量的比较300μU/mL胰岛素浓度的富血小板血浆,在不同浓度阿司匹林0,75,150,和300μmol/L的孵育下,合成TXB2的含量3.65±0.07,1.68±0.68,1.37±0.69,1.08±0.55ng/mL显著高于相应的30μU/mL的TXB2的含量3.43±0.59,1.00±0.51,0.86±0.44,0.85±0.40ng/mL,差异有统计学意义(P<0.05)。3. cGMP合成量的比较在30μU/mL和300μU/mL的胰岛素浓度的条件下,阿司匹林能够增加血小板内的cGMP的含量(P<0.05),这种效应是由于NO诱导的鸟苷酸环化酶活化所致。但是,鸟苷酸环化酶抑制剂MB和NOS抑制剂L-NMMA对此通路并没有产生相应的影响。结论本研究表明,体外实验中,血小板暴露于高浓度的胰岛素(300μU/mL)环境中,将会减弱阿司匹林对血小板的抗聚集效应,同时使TXA2的含量增加,但是并不影响NO/cGMP的合成。本研究揭示了,在2型糖尿病中,胰岛素对血小板活化所起的作用,从一种新的角度探索胰岛素在抗血栓治疗中所起的综合作用。