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背景与目的:动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种以大动脉管壁上出现脂质和纤维成分聚积为特征的慢性、进行性疾病,是导致冠心病、心肌梗死(myocardial infarction,MI)和周围血管疾病等的主要原因。内皮细胞(endothelial cells,ECs)出现功能障碍是AS整个过程中的始发因素,而血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的异常增殖和迁移亦是动脉粥样硬化斑块形成、发展以及重构的主要原因。因此,ECs和VSMCs的增殖和迁移被认为是AS发生发展过程中至关重要的因素。近年来,大量研究结果显示microRNAs(miRNAs,miRs)参与了众多生物学过程,这使得miRNAs作为影响疾病发生发展的因素之一受到了广泛的关注。与此同时,亦有研究结果证实在动脉粥样硬化斑块形成及发展过程中,miRNAs可以通过调控ECs和VSMCs的生物学功能而在其中起着重要的作用。在目前的研究中,miR-362-3p主要作为抑癌基因或致癌基因参与了不同种类癌症的发生发展,其在AS中的作用还不清楚。本研究检测了 miR-362-3p在冠状动脉粥样硬化性心脏病人和对照组人群血浆中的表达,并进一步明确miR-362-3p通过调控其靶基因含I型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶1(adisintegrinand metalloproteinase with thrombospondin-like motifs 1,ADAMTS1)的表达,对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)和VSMCs的增殖和迁移的影响,为AS的防治提供了新的理论依据。方法:应用实时荧光定量 PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术检测110例冠心病病人和84例对照组人群血浆中miR-362-3p的表达情况。培养 HUVECs 和 VSMCs,分别将 miR-362-3p mimic 和miR-362-3p inhibitor 转染入细胞,qRT-PCR 实验检测 miR-362-3p 的表达水平。CCK-8实验检测miR-362-3p对HUVECs和VSMCs增殖的影响。细胞流式实验(flow cytometry,FCM)检测miR-362-3p对细胞周期的影响。细胞划痕实验检测miR-362-3p对HUVECs和VSMCs迁移情况的影响。应用生物信息学软件预测到miR-362-3p的靶基因为ADAMTS1。利用分子克隆技术,构建pGL3-ADAMTS13’-UTR载体及突变体。培养HEK293细胞,将miR-362-3p和pGL3-ADAMTS13’-UTR或突变体共转染入细胞中,双荧光素酶报告基因实验检测各个转染组荧光强度的变化。培养HUVECs和VSMCs,应用Lipofectine2000将 miR-362-3p mimic 及 inhibitor 转入细胞中,qRT-PCR 实验和 western blot实验分别检测ADAMTS1 mRNA和蛋白水平的变化。应用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测病例组和对照组病人血浆中ADAMTS1的含量。构建pcDNA3.1-ADAMTS1表达质粒,将 pcDNA3.1-ADAMTS1 和 miR-362-3p mimic 共转染入HUVECs和VSMCs中。应用Western blot实验检测ADAMTS1的表达。CCK-8实验检测细胞的增殖情况。应用FCM实验检测HUVECs和VSMCs周期变化情况。细胞划痕实验检测HUVECs和VSMCs的迁移情况。结果:qRT-PCR结果显示,miR-362-3p在冠状动脉粥样硬化性心脏病人血浆中的表达与对照组病人相比降低了 70%。在HUVECs中成功过表达 miR-362-3p 后,CCK-8 结果显示,miR-362-3p 促进了 HUVECs 的增殖。FCM结果显示,过表达miR-362-3p使得HUVECs的G0/G1期细胞百分比从40.47%降低到32.28%,而S期细胞百分比从41.25%升高至50.09%。细胞划痕实验结果说明,miR-362-3p可以促进HUVECs的迁移。应用生物信息学软件预测出可能参与到冠心病发生发展过程中的miR-362-3p的靶基因之一为ADAMTS1。双荧光素酶报告基因实验结果显示miR-362-3p可以降低ADAMTS1 3’-UTR区域的荧光素酶活性。在HUVECs中过表达miR-362-3p时,ADAMTS1基因mRNA水平降低了49%,蛋白表达水平降低了 45%。ELISA结果显示ADAMTS1在冠心病组人群中表达显著高于对照组人群。在HUVECs中共转染 miR-362-3p mimic 与 pcDNA3.1-ADAMTS1 质粒后,ADAMTS1蛋白表达水平升高了 321%。CCK-8和细胞划痕实验结果显示共转染ADAMTS1抑制了 HUVECs的增殖和迁移。FCM实验结果显示,与对照组相比较,共转染ADAMTS1后HUVECs的G0/G1期细胞百分比从34.02%上升到56.25%,而S期则由57.46%下降到38.89%。在VSMCs中过表达miR-362-3p后,miR-362-3p的表达水平升高了 490%。CCK-8实验结果显示,过表达miR-362-3p抑制了 VSMCs的增殖。FCM结果显示,与对照组相比,过表达miR-362-3p后VSMCs的G0/G1期细胞百分比从24.23%增加到38.51%,S期细胞百分比从56.07%降低至39.37%。细胞划痕实验结果表明,过表达miR-362-3p可以抑制VSMCs的迁移。qRT-PCR和western blot结果显示,与对照组比较,miR-362-3p mimic转染组ADAMTS1基因mRNA水平下降了44%,而蛋白水平则降低了 35%。在VSMCs中共转染miR-362-3pmimic与pcDNA3.1-ADAMTS1后,ADAMTS1蛋白表达水平升高了 359%。CCK-8和细胞划痕实验结果显示共转染ADAMTS1促进了 VSMCs的增殖和迁移。FCM实验结果显示,与对照组相比较,共转染ADAMTS1后VSMCs细胞G0/G1期细胞百分比从39.50%下降到31.76%,而S期则由43.46%升高到51.62%。结论:本实验研究结果表明,miR-362-3p在冠心病病人血浆中表达显著降低,而ADAMTS1在冠心病病人血浆中表达明显升高。在HUVECs中过表达miR-362-3p后,miR-362-3p可以通过抑制其靶基因ADAMTS1的表达促进HUVECs的增殖、迁移及周期转换过程。而在VSMCs中过表达miR-362-3p后,miR-362-3p则会通过下调ADAMTS1的表达抑制VSMCs的增殖、迁移和周期转换。上述结果表明在AS中,miR-362-3p可以通过下调ADAMTS1的表达参与HUVECs和VSMCs的增殖迁移过程。通过对miR-362-3p及其下游靶点的调节可能为临床防治AS提供新的分子机制。