过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators activated receptors , PPARs)属于非甾体类核受体超家族,存在3种亚型,包括PPARα、PPARγ和PPARδ(亦称PPARβ)。当其与配体结合后被激活,构象发生改变并与视黄醇X受体( retinoid X receptor, RXR)结合成异二聚体,同时释放共抑制蛋白并结合辅激活蛋白,形成一个包含多亚单位的协同激活物,再与靶基因启动子区域的过氧化物酶体增殖物反应元件(peroxisome proliferators response element, PPRE)结合,从而发挥对靶基因的转录调控作用。多年来,PPARs一直是人类代谢相关疾病防治药物的重要靶点。贝特类降脂药和噻唑烷二酮类(Thiazolidinedione,TZD)降糖药已被广泛用于临床,它们分别通过激活PPARα和PPARγ发挥效应。目前认为,PPARγ激动剂主要通过作用于脂肪组织、促进脂肪细胞分化、促使葡萄糖向脂肪组织转运等环节,实现其胰岛素增敏进而降低血糖的药理作用,但是往往存在增加患者体重的副作用,而Ⅱ型糖尿病患者又常伴随超重。因此,如何规避这类药物的副作用,一直是临床应用中面临的重要问题。鉴于PPARα激动剂可以促进肝脏脂类的氧化代谢,有望弥补PPARγ激动剂的不良作用,因此,PPARα/γ双重激动剂近来被寄予厚望。与PPAR各亚型的单一激动剂相比,PPARα/γ双重激动剂具有更好的开发潜力,已成为当前该领域新药研发的重要方向。TZD类药物除了上述胰岛素增敏途径之外,噻唑烷二酮类还通过抑制肝脏糖异生作用实现其降血糖效应。然而,这类药物抑制糖异生的分子机制仍不明确。由于PPARγ是转录激活因子,它很可能需要其它靶分子介导实现其对糖异生关键酶的影响。最新的体外研究显示,小异二聚体伙伴分子(SHP)与肝细胞糖异生相关基因表达的调节密切相关,但仍缺乏体内实验结果的佐证。本研究包括两方面研究内容:一是建立适于PPAR转录激活效应检测的细胞模型,用于筛选PPARα及γ两亚型的双激动剂;二是利用Ⅱ型糖尿病自发大鼠模型,探讨吡格列酮的药理作用特点,特别是它抑制糖异生的分子机制。简要总结如下:一、PPARα/γ双重激动剂细胞筛选模型的建立,主要包括报告基因载体构建和细胞转染等内容。首先是报告基因的构建:设计合成一对引物,PCR扩增含有PPRE序列的乙酰辅酶A氧化酶(acyl-CoA oxidase, ACO)启动子片段,并将该片段与pGL3通过连接反应、转化重组、测序,得到荧光素酶报告基因质粒pGL3-PPRE。然后再进行靶细胞转染,分别提取中国仓鼠卵巢癌细胞(CHO)、人胚胎肾细胞(Hek293)及人肝癌细胞(HepG2)总RNA,并以RT-PCR法检测PPAR基因mRNA水平在各细胞株中的表达。结果显示:HepG2细胞中PPARα、PPARγ基因表达都相对较低。加之HepG2转染效率高、传代容易,因此,我们选用HepG2作为靶细胞。将所构建的报告基因质粒pGL3-PPRE及内参照质粒pRL-TK瞬时转染至HepG2中,得到基于细胞的筛选模型,并通过以下两种情形对模型进行检测:一方面,检测表达质粒pSG5-PPARα或pSG5-PPARγ与报告基因质粒共转染(非共转染组作为对照)对荧光素酶水平的影响;另一方面,将非诺贝特或吡格列酮分别作用于共转染组和非共转染组细胞,观察它们对细胞荧光素酶水平的影响。结果显示:表达质粒pSG5-PPARα、pSG5-PPARγ共转染组细胞的荧光素酶水平较非共转染组显著上升;非诺贝特或吡格列酮作用后,共转染和非共转染两组的荧光素酶水平均显著增加,并呈一定的剂量依赖性。所建细胞模型能够灵敏反映PPAR的激活效应。为了验证筛选模型的特异性和可靠性,在以一定浓度非诺贝特预先作用于pSG5-PPARα共转染细胞,或一定浓度吡格列酮预先作用于pSG5-PPARγ共转染细胞的情况下,再检测PPARα拮抗剂MK886或PPARγ拮抗剂GW9662对转染细胞荧光素酶的效应。结果发现,在0~10μmol·L-1的浓度范围内,GW9662或MK886特异性抑制剂分别抑制非诺贝特或吡格列酮的作用,具有一定的浓度效应关系,说明细胞模型不仅反应灵敏,而且还表现出较强的特异性和可靠性。二、PPARα及γ亚型双重激动剂的筛选。利用上述细胞模型,即将PPARα(或PPARγ)表达质粒、报告基因质粒和内参照质粒共转染HepG2细胞中,并以仅转染报告基因质粒和内参照质粒的细胞作为对照,将五个合成化合物(LTD-1, 3, 4, 6, 7)分别以不同浓度作用于转染细胞24h,然后裂解细胞,测定细胞内报告基因质粒的荧光素酶活性,后者表示化合物对PPARα(或PPARγ)的激活强度。检测结果表明,LTD-6、LTD-7均具有激活PPARα和PPARγ的双重效应,以LTD-7的激活效应最为显著。LTD-4仅能激活PPARα,LTD-1则仅能激活PPARγ,而LTD-3对PPARα和PPARγ均无明显的激活作用。三、吡格列酮抗糖异生作用机制的探讨。选用Ⅱ型糖尿病自发性模型GK大鼠为实验对象。将GK大鼠随机分为3组:模型对照组、吡格列酮小剂量组(5mg/kg/d)和吡格列酮大剂量组(10mg/kg/d)。另设Wistar大鼠为正常对照组。大鼠连续灌胃给药14天,并在给药前、给药期间及给药后动态测定大鼠血糖、体重变化;给药结束后次日进行糖耐量试验,RT-PCR测定肝脏中PPARγ、PEPCK、G6P、FBP1、SHP mRNA表达。结果显示,与模型对照组比较,吡格列酮给药组大鼠血糖明显下降,糖耐量水平增强,但伴随着体重增加;与此同时,该组大鼠肝脏组织中PPARγ、SHP的mRNA表达增加,而糖异生过程中三个关键酶PEPCK、G6P、FBP1的mRNA表达被抑制。结论:1、成功获得了含有PPRE的ACO启动子序列,并构建了荧光素酶报告基因质粒pGL3-PPRE;2、将所构建的质粒与表达质粒共转染于HepG2细胞中,得到的转染细胞模型适于PPARα和PPARγ转录激活作用的分析;3、化合物LTD- 6,7具有激活PPARα和PPARγ的双重作用,以LTD-7的作用最为显著,值得深入研究;4、吡格列酮对自发性Ⅱ型糖尿病大鼠具有良好的降糖效应,但伴随明显的体重增加;对大鼠肝脏糖异生作用关键酶PEPCK、G6P、FBP1的mRNA表达抑制明显,而增加PPARγ、SHP的mRNA表达,揭示了PPARγ激动剂的降糖效应,其途径之一是通过抑制糖异生得以实现,而且提示SHP很可能介入了PPARγ调控糖异生的过程。该发现进一步丰富了吡格列酮药理作用机制的认识。