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杆状病毒是一类特异性感染昆虫的病原体,目前已成功开发为外源蛋白表达载体,基因治疗载体以及生物杀虫剂。在杆状病毒的感染生活史中,产生两种不同类型的病毒粒子:出芽型病毒粒子BV(Budded Virus)和包埋型病毒粒子ODV(Occlusion-derived Virus)。BVs介导了病毒在细胞间的传播,最终建立虫体的系统感染。而ODVs在碱性中肠环境中从包涵体中释放后介导中肠柱状上皮细胞的感染。已知,ODV入侵中肠上皮细胞的早期事件是由口服感染因子PIFs(per osinfectivity factors)介导的。然而口服感染相关因子及ODV特异性的囊膜蛋白的确切功能尚不特别明确。本论文对ODV特异性囊膜蛋白P74,PIF4(HA85)及HA72的功能进行了深入研究,旨在揭示杆状病毒口服感染的分子机制。 第一章对研究背景做了详细介绍。包括杆状病毒简介,口服感染研究及HearNPV相关研究等。 之前的研究表明,在AcMNPV(Autographa californica multiplenucleopolyhedrovirus)中,ODV结合蛋白P74,经过了两次剪切事件。第一次由OBs(Occlusion Bodies)内源性的蛋白酶在裂解释放过程中剪切,然而剪切位点并未鉴定。第二次经由中肠中的胰蛋白酶剪切,发生在氨基酸区域R195/R196/R199。第二章中我们发现不同于AcMNPV,HearNPV(Helicovepa armigera singlenucleopolyhedrovius) P74的第一次剪切发生在细胞系中蛋白质翻译后,并且这一剪切不依赖ODV裂解释放过程中的内源性蛋白酶。此次剪切产生了两条分子量大小相当不以二硫键连接的亚单位。基于剪切下来的条带的大小,此次剪切可能发生在P74的中间R/K富集区域,这一区域在亲缘关系较远的NVs和SGHVs中也较为保守。随后,为分析此处的剪切位点,构建了一系列的点突变重组病毒。口服感染实验结果显示,单点和多点突变的重组病毒均使得口服感染的能力显著降低,且四点突变的重组病毒R334Q/R339Q/R344Q/R347Q消除了P74在此处的剪切。另外,我们还构建了可能的第二个剪切位点突变的重组病毒R220Q/R221Q/R224Q,生测表明,这一区域对口服感染是必需的。以上结果表明,虽然AcMNPV和HearNPV的P74第一次剪切发生的时间不同,但剪切位点在两种病毒中都是保守的。章节最后整合了P74剪切的模式图。 第三章,我们探究了HearNPV ORF85的功能,尤其是其在口服感染中的作用及与其他PIF蛋白的相互作用。HA85是AcMNPV口服感染因子PIF4(AC96)的同源物。我们的研究结果显示,ha85的缺失导致口服感染能力完全丧失。Western Blot及免疫共沉淀(Co-IP)分析表明HearNPV PIF1,PIF2及PIF3形成稳定复合物。虽然Western Blot和Co-IP并未发现HA85与PIF复合物有关联,然而进一步分析揭示ha85缺失导致PIF复合物不能正确组装。Y2H分析进一步显示HA85同P74,PIF1,PIF2及PIF3之间的相互作用。总而言之,HA85定义为HearNPV的口服感染因子PIF4,并通过与其他PIF蛋白的相互作用参与了HearNPV PIF复合体的形成。 第四章对核心基因HearNPV ha72(同源物为ac78)进行了鉴定。通过其转录时相和表达时相分析发现,ha72为晚期基因,其编码的蛋白感染过程中亚细胞定位于核膜环带区。生物信息学分析学分析发现HA72在N端包含一个高度保守的IPLKL基序,在C端存在一个FRF(fumarate reductase flavoprotein)C端基序,后者可能参与氧化还原反应。进一步实验发现,ha72的缺失使得转染细胞不能产生感染性BVs,表明其对BV的产生是必需的;且对病毒DNA的复制没有影响。通过电镜观察发现,在ha72缺失的Bacmid转染的细胞中,能形成正常形态的ODVs,然而却不能包装至包涵体,即形成了空的多角体,此现象表明HA72参与了ODV的包埋过程。另外IPLKL基序突变的重组病毒表明第22位赖氨酸对HA72发挥功能具有重要作用。K22E的突变导致感染性病毒粒子BVs产量下降,ODVs包埋受阻。研究还发现HA72同P33的相互作用。P33是已被鉴定的杆状病毒巯基氧化酶,与病毒的形态发生相关。我们推测此两种蛋白在病毒的感染过程中形成复合体发挥功能。上述研究表明HA72在病毒生活史中是必需的,参与感染性BV的产生及ODV的包埋,同时,还可能同P33的相互作用而参与氧化还原反应。 如前所述,生物信息学分析发现HA72 C端存在FRF基序,然而其功能并不清楚。第五章中,通过同源建模发现HA72 C端与血红素氧合酶同源,并预测了HA72的3D结构,以及C端基序中可能与底物结合的五个氨基酸位点:L87,Y91,V94,I95,E98。通过点突变技术,构建了上述五个氨基酸位点分别突变为丙氨酸(A)的重组病毒。转染和感染表明,所有点突变病毒均能产生感染性病毒粒子BVs。然而病毒产生动力学曲线分析发现突变体Y91A,V94A,I95A,E98A导致BVs产量下降约十倍。另外,透射电镜观察及免疫荧光定位分析发现五个点突变重组病毒都不影响核多角体病毒OBs的形态发生及HA72在感染性细胞中的定位。 论文的最后一章对本文中的研究成果进行了总结。