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结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率均位于前列。近年来,尽管CRC的临床治疗技术取得了较大的发展,但晚期患者的预后仍不理想。侵袭与转移是CRC患者死亡的主要原因。因此,有必要寻找CRC生长、转移的驱动因子,探索影响CRC进展的机制,寻找晚期CRC治疗的新靶点。腺瘤性结肠息肉病基因(adenomatous polyposis coli,APC)及其同源产物APC2的功能缺失或β-catenin的致癌性突变是大多数散发性CRC的限速事件。β-catenin在位于侵袭前沿和迁移至基质的肿瘤细胞内表现为高信号,这种差异性Wnt信号传导活性反映了细胞不同的增殖和上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)能力,影响肿瘤生长和侵袭转移等恶性行为。环状RNA(circular RNA,circ RNA)是一种环状闭合结构的特殊RNA,可通过竞争性结合相应的微小RNA(micro RNA,mi RNA),间接调节靶基因的表达,发挥重要的转录后调控作用,即竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ce RNA)机制。一些circ RNA被发现在CRC中表达异常,并与肿瘤大小、临床分期以及患者预后密切相关。然而,circ RNA作为ce RNA,在CRC的发展进程,尤其在EMT相关性侵袭转移中,与吸附的mi RNA及下游靶基因之间的竞争性调控模式尚不明确,有待进一步研究。本研究分三个部分,第一部分通过circ RNA芯片筛选CRC和癌旁组织中差异表达的circ RNA,并检测hsa＿circ＿0009361在CRC组织和细胞中的表达水平;第二部分通过体外实验和体内实验明确hsa＿circ＿0009361在CRC中的生物学功能;第三部分应用生物信息学方法和细胞实验阐明hsa＿circ＿0009361/mi R-582/APC2构成ce RNA网络,影响CRC进展的机制。第一部分hsa＿circ＿0009361在CRC组织和细胞中的表达特征【目的】明确CRC组织与癌旁组织中circ RNA的表达谱,筛选表达差异最显著的circ RNA。【方法】通过circ RNA微阵列分析,分析10对CRC组织与癌旁非肿瘤组织中circ RNA的表达差异,在20对新鲜CRC组织中应用q RT-PCR方法进行验证。选择表达差异最显著的circ RNA,应用q RT-PCR检测其在各CRC细胞株中的表达水平。【结果】在15095个circ RNA中,有48个circ RNA在CRC组织与癌旁组织的差异表达较为显著(Fold Change>2,P<0.05),其中40个circ RNA在CRC组织中表达显著上调,8个circ RNA在CRC组织中表达显著下调。应用q RT-PCR方法进行验证,5个表达上调最显著的circ RNA分别为:hsa＿circ＿0000423、hsa＿circ＿0000512、hsa＿circ＿0000511、hsa＿circ＿0000467和hsa＿circ＿0000231;5个表达下调最显著的circ RNA分别为:hsa＿circ＿0009361、hsa＿circ＿0012185、hsa＿circ＿0001455、hsa＿circ＿0000775和hsa＿circ＿0001669。其中,hsa＿circ＿0009361在CRC组织中表达下调最显著(FC=31.25,P<0.001)。与人正常结肠上皮细胞NCM460相比,hsa＿circ＿0009361在CRC细胞HT29,SW480,HCT-116,Lovo,SW48,DLD-1和Caco-2中均显著低表达。【结论】在CRC组织中表达异常上调的circ RNA多于异常下调的circ RNA。hsa＿circ＿0009361在CRC组织中表达下调最为显著,并且在大多数CRC细胞系中其表达水平显著低于正常结肠上皮细胞。第二部分hsa＿circ＿0009361在CRC中的生物学功能【目的】明确hsa＿circ＿0009361在CRC细胞和动物模型中发挥的生物学功能。【方法】构建hsa＿circ＿0009361过表达载体以及覆盖hsa＿circ＿0009361反向剪接区域的si RNA,分别转染HCT-116细胞和Lovo细胞,建立hsa＿circ＿0009361过表达HCT-116细胞株和hsa＿circ＿0009361沉默的Lovo细胞株。应用CCK-8细胞增殖实验检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡水平,细胞划痕实验和Transwell侵袭实验分别用于检测细胞的迁移和侵袭能力。将hsa＿circ＿0009361过表达HCT-116细胞、转染空载体的HCT-116细胞和未经转染处理的HCT-116细胞分别皮下接种到BALB/c裸鼠背部,建立移植瘤模型,定时测量肿瘤体积和重量。将上述三种HCT-116细胞分别通过尾静脉注射到BALB/c裸鼠,建立转移模型,观察对比肺转移瘤的数量。应用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色检测小鼠肿瘤组织中APC2、E-钙粘蛋白和β-catenin的表达水平。【结果】在HCT-116细胞中过表达hsa＿circ＿0009361可以抑制细胞增殖,促进凋亡,并显著降低细胞的迁移和侵袭能力。在Lovo细胞中沉默hsa＿circ＿0009361则可以促进细胞的迁移和侵袭,但对细胞增殖和凋亡水平无明显影响。此外,过表达hsa＿circ＿0009361可以显著升高HCT-116细胞中E-钙粘蛋白的表达水平,降低波形蛋白的表达水平,而沉默hsa＿circ＿0009361则可以显著降低Lovo细胞中E-钙粘蛋白的表达水平,升高波形蛋白的表达水平。在动物实验中,hsa＿circ＿0009361过表达组小鼠肿瘤的平均体积和重量均显著低于对照组,肺转移瘤的平均数量也明显低于对照组。IHC显示,与对照组相比,hsa＿circ＿0009361过表达组小鼠的肿瘤组织中APC2和E-钙粘蛋白的表达水平升高,而β-catenin的表达水平降低。【结论】hsa＿circ＿0009361可以抑制CRC细胞增殖,促进凋亡,并对E-钙粘蛋白和波形蛋白分别具有正性和负性调节作用,通过阻断EMT过程显著降低CRC细胞的迁移和侵袭能力。hsa＿circ＿0009361在体内也能够显著抑制CRC的生长和转移,其机制可能与Wnt/β-catenin通路活性有关。第三部分hsa＿circ＿0009361/mi R-582/APC2构成ce RNA网络影响CRC进展的机制【目的】鉴定hsa＿circ＿0009361吸附的mi RNA及其靶基因,阐明hsa＿circ＿0009361通过ce RNA网络影响CRC进展的机制。【方法】通过生物信息学方法筛选hsa＿circ＿0009361可能结合的mi RNA,q RT-PCR检测其在CRC组织中的表达水平。调节CRC细胞中hsa＿circ＿0009361的表达,观察目标mi RNA表达水平的变化。RNA荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)观察hsa＿circ＿0009361与目标mi RNA在HCT-116细胞中的共定位。RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)和双荧光素酶报告实验验证hsa＿circ＿0009361与目标mi RNA的结合关系。应用生物信息学方法筛选目标mi RNA可能调控的靶基因,RIP和双荧光素酶报告实验验证目标mi RNA与该靶基因的结合关系。调节HCT-116细胞中hsa＿circ＿0009361与目标mi RNA的表达,western blotting检测靶基因的表达水平,TOP/FOP Flash双荧光素酶报告实验评估Wnt/β-catenin通路活性。细胞功能回复实验验证上述结果。【结果】在生物信息学方法筛选出的与hsa＿circ＿0009361具有互补序列的候选mi RNA中,mi R-582在CRC组织中的表达与hsa＿circ＿0009361的表达水平呈负性相关。在CRC细胞中,mi R-582的表达也受到hsa＿circ＿0009361的负性调节。RNA FISH显示hsa＿circ＿0009361和mi R-582共定位于HCT-116的细胞质中。RIP和双荧光素酶报告实验证明,hsa＿circ＿0009361和mi R-582可以直接结合。通过生物信息学方法、RIP和双荧光素酶报告等实验,确定APC2是mi R-582调控的靶基因,APC2的表达以及Wnt/β-catenin通路活性均受到hsa＿circ＿0009361和mi R-582的调控。回复实验证实,mi R-582和APC2均可阻断hsa＿circ＿0009361所介导的CRC细胞在增殖、迁移和侵袭能力方面的改变。【结论】hsa＿circ＿0009361是mi R-582的海绵,Wnt/β-catenin通路抑制剂APC2是mi R-582调控的靶基因。hsa＿circ＿0009361可作为ce RNA,通过竞争性结合mi R-582,间接上调APC2的表达,抑制Wnt/β-catenin通路的活性。hsa＿circ＿0009361在CRC中的异常低表达使其抑癌作用减弱,促进CRC的进展。