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奶牛乳房炎是奶牛养殖业中发病率最高的疾病之一,该病防治困难,可对养牛业造成巨大经济损失,严重威胁人类健康。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是引起该病的重要病原菌,该菌分泌多种致病因子,易产生耐药性且具有免疫逃避特性,防治极为困难。EsxB作为S.aureus外分泌蛋白,在该菌的感染过程中可发挥重要作用,参与毒素的分泌及脓肿的形成。目前有关EsxB功能研究较少,本研究旨在近一步阐明该蛋白的免疫生物学特性。本研究扩增EsxB基因并构建原核重组表达质粒,诱导及表达EsxB蛋白。将纯化后的蛋白免疫小鼠,比较分析该蛋白的免疫特性。为进一步评估比较EsxB的免疫效果,本研究将该蛋白与本室前期构建与表达的5种蛋白Esx A、Ef B、Clf A、Fli C、Flj B分组免疫小鼠,运用ELISA方法检测免疫小鼠血清中特异性抗体水平、抗体亚型。SDS-PAGE电泳及Western-blot检测结果表明,获得了可高效表达的可溶性EsxB重组蛋白,大小为17.6 k Da。EsxB免疫小鼠后抗体效价可达1:729000,与对照组相比差异显著(P<0.05)。抗体亚型主要以Ig G1和Ig G2b为主且Ig G1明显高于Ig G2a,Ig G2b明显高于Ig G3(P<0.05)。EsxB+Esx A,EsxB+Esx A+Clf A免疫组抗体水平明显高于EsxB+Flj B及EsxB+Fli C免疫组(P<0.05)。本研究结果显示,联合免疫组可诱导较强的体液免疫反应。对免疫后小鼠心、肝、脾、肺、肾组织中菌体载量进行检测、攻毒小鼠进行病理组织学观察、攻毒后存活率检测等。结果表明,Esx A及EsxB免疫组小鼠组织荷菌量明显低于Fli C、Flj B、Ef B免疫组,EsxB+Esx A+Clf A免疫组荷菌量最低(P<0.05)。攻毒小鼠病理组织学观察发现,S.aureus GW(20-2)攻毒小鼠肝、脾、肾、肺等出现了明显的病理变化,该菌对小鼠的肺脏和脾脏损伤较大,主要表现组织的出血、充血、炎性细胞浸润和组织变性。Esx A+EsxB联合免疫小鼠后对这些病变减轻且显著改善。攻毒后存活率结果显示,EsxB+Esx A+Clf A联合免疫组存活率达到100%,EsxB重组蛋白对小鼠的存活率达75%,高于Ef B免疫组(62.5%);Esx A+EsxB联合免疫组的存活率(100%),高于Esx A免疫组(87.5%)和EsxB免疫组(75%)。该结果表明,Esx A+EsxB和Esx A+EsxB+Clf A联合免疫可更好的保护小鼠抵抗S.aureus的攻击。利用流式细胞检测免疫细胞亚型并用荧光定量PCR免疫组免疫相关分子含量进行检测。荧光定量PCR结果显示,各免疫组小鼠,TLR2、TLR3、TLR4、MHC-Ⅰ、RP105、TCR与IL-10表达水平均有升高,联合免疫组TLR2、TLR3、TLR4表达量均明显高于单独免疫组(P<0.05);EsxB免疫组各免疫相关分子的表达水平都较低;EsxB+Esx A+Fli C免疫组TLR2、TLR3、TLR4、MHC-Ⅰ、RP105、TCR表达水平均高于其他免疫组;EsxB+Esx A+Clf A免疫组IL-10表达量最多(P<0.05),高于其他免疫组;Ef B免疫组TLR2、TLR3、TLR4、MHC-Ⅰ、RP105、TCR表达水平均高于其他蛋白单独免疫组。流式细胞检测结果显示各免疫组CD4~+T、CD8~+T、CD69~+T细胞表达量均显著升高(P<0.05),EsxB+Esx A及Esx A免疫组CD4~+T、CD8~+T、CD69~+T细胞表达水平高于EsxB免疫组且EsxB+Esx A联合免疫组T细胞表达水平最高。该结果表明,EsxB+Esx A联合免疫后能够刺激小鼠产生更强的T细胞免疫应答,达到清除S.aureus的目的。该研究结果为EsxB作为亚单位疫苗防治奶牛乳房炎奠定了实验基础。