结直肠癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一,发病率位于恶性肿瘤的第三位,死亡率居于恶性肿瘤致死原因的第五位。结直肠癌的发生发展是一个涉及多基因遗传学和微环境改变的累积过程。K-ras基因点突变在结直肠癌发生率近45%,该部分患者对传统化疗药物耐受增加,表皮生长因子受体抑制剂等靶向分子治疗亦往往失效。另外,结肠肿瘤生长速度超过新生血管形成时,局部微环境就表现为低氧状态。低氧微环境(<2%O2)是结直肠癌的重要生长特性之一,它不仅使肿瘤细胞对化疗耐药增加,还促进肿瘤血管生成和侵袭性。为了系统性探讨K-ras突变型结直肠癌细胞在“低氧”微环境下的细胞适应模式,我们前期通过cDNA微阵列芯片分析筛选到ADM是低氧下K-ras突变型结直肠癌细胞的关键下游基因,发现ADM在K-ras突变型结直肠癌组织中高表达,并促进结直肠癌细胞侵袭。ADM是Kitamura等从人的嗜铬细胞瘤中发现并分离出来的一种血管活性肽,生理状态下,ADM可以通过与受体结合,增加cAMP水平,促进血管生成,影响血管张力和通透性,同时已有许多研究表明其与肿瘤血管生成密切相关。ADM作为一种血管活性肽,它需要通过与受体的结合才能起作用,可以与它结合的受体主要包括两种,即ADM特异性受体(ADMR)和降钙素受体样受体(CRLR).本研究将通过检测结直肠癌组织及癌细胞株中ADM、ADMR及CRLR的表达水平,分析其与临床病理特征之间的相关性,从而明确ADM及其受体在结直肠癌恶性生物学行为中的作用；通过RNA干扰技术,构建特异性／ADMR及CRLR shRNA重组慢病毒转导入结肠癌细胞,观察结直肠癌细胞恶性生物学行为(细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移)的变化；并采用基因芯片表达谱技术筛选ADMR和CRLR潜在的下游互作基因并进行初步验证。具体研究内容包括四部分：1.ADM.ADMR及CRLR在结直肠癌中的表达及与结直肠癌病理特征之间的相关性①qPCR检测26对结直肠癌及正常组织,20对结直肠癌旁组织中ADM, ADMR及CRLR mRNA表达水平；②结合临床资料分析ADM、ADMR及CRLR表达水平与结直肠癌临床各病理参数之间的关系；③RT-PCR和Western blot检测7种结直肠癌细胞株中ADMR及CRLR的表达。2. ADMR及CRLR shRNA重组慢病毒表达载体的构建和验证①qPCR和Western Blot验证能有效抑制人结直肠癌细胞ADMR和CRLR表达的siRNA序列；②根据验证的siRNA序列构建重组shRNA质粒,包装LV-ADMR shRNA和LV-CRLR shRNA,并转染人结直肠癌细胞RKO和HT-29, RT-PCR和Western Blot分别测定两株细胞中ADMR及CRLR mRNA和蛋白的表达水平,证实干扰成效。3.特异性ADMR及CRLR干扰后结直肠癌细胞RKO和HT-29恶性生物学行为的变化①采用MTS实验观察ADMR及CRLR干扰对RKO和HT-29细胞增殖的影响；②采用流式细胞仪检钡ADMR及CRLR干扰对RKO细胞凋亡和细胞周期的影响；③Transwell实验研究ADMI及CRLR对结直肠癌细胞迁移及侵袭的影响。4.ADMR及CRLR潜在的下游互作基因的初步筛选及验证在稳定转染ADMR及CRLR shRNA的RKO细胞中利用Metastasis基因PCR阵列分析筛选出与结直肠癌转移相关的下游互作基因；对其中6个候选互作基因分别在稳定转染ADMR及CRLR shRNA的RKO和HT-29细胞中进行qPCR验证。所得研究结果如下：1.ADM、ADMR及CRLR在结直肠癌中高表达①结直肠癌组织中的ADM及CRLR mRNA水平均较配对正常组织显著上调(0.0986±0.0799/0.0660±0.0708, p=0.0181;0.121±0.0175/0.0064±0.0089, p=0.0083,n=26),ADMR.mRNA水平虽较配对正常组织上调,但差异并无统计学意义(0.0034±0.0039/0.0031±0.0034, p=0.4548, n=26).结直肠癌癌旁组织中的CRLRmRNA水平较配对正常组织显著上调(0.0069±0.0086/0.0037±0.0041,p=0.0146,n=20), ADM mRNA水平也较配对正常组织上调,但差异无统计学意义(0.0935±0.0751/0.0742±0.0771, p=0.0821, n=20), ADMR mRNA水平与配对正常组织的差异无统计学意义(0.0035±0.0032/0.0038±0.0036,p=0.4429,n=20)；②在两组有无淋巴结转移的结直肠癌组织中,ADM. ADMR及CRLR mRNA的表达均有统计学差异(p=0.0000/0.0261/0.0092)。在20例癌旁组织中,8例淋巴结转移(TNMⅢ期)与12例无淋巴结转移(TNMⅠ和Ⅱ期)比较,伴有淋巴结转移患者的癌旁组织中,ADM. ADMR及CRLR mRNA的表达均显著上调(p=0.0005/0.0225/0.0318)。6例低分化癌与20例高-中分化癌比较,在低分化癌患者的结直肠癌组织中CRLR mRNA的表达显著上调(p=0.0156)。结直肠癌和癌旁组织中ADM、ADNR及CRLR mRNA表达水平与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、浸润深度和五年生存状况无明显相关性(p>0.05)；③ADMR mRNA的表达在SW620、RKO、HT29、DLD-1及LOVO等结直肠癌细胞株中相对较高；CRLR mRNA的表达在SW480、SW620、RKO、HT29、DLD-1及HCT116中相对较高；ADMR蛋白表达在RKO和LOVO细胞株中水平较高；CRLR蛋白表达在HT29和HCT116细胞株中水平较高。筛选出RKO和HT-29二株肠癌细胞作为综合高表达的细胞株。2.ADMR及CRLR shRNA重组慢病毒表达载体的构建和验证①qPCR检siRNA对ADB MR及CRLR的干扰效应,ADMR下调68.8%,CRLR下调了97.3%,Western Blot检测结果与其一致,证明干扰靶点有效；②稳定转染了LV-ADMR shRNA和LV-CRLR shRNA的RKO和HT-29二株细胞出现了ADMR及CRLR基因干扰,即ADMR和CRLR mRNA和蛋白表达显著下调。3.干扰ADMR及CRLR表达可抑制结直肠癌的生长和侵袭①ADMR shRNA和CRLR shRNA均能抑制RKO和HT-29细胞的增殖,联合ADMR+CRLR shI RNA的作用更为显著(p<0.01)；②联合干扰ADMR及CRLR可致RKO细胞早期凋亡和总凋亡增加(13.16%/5.03%；22.73%/9.26%)；单纯干扰CRLR和联合干扰ADMR及CRLR可致HT-29细胞早期凋亡和总凋亡增加(20.48%,22.43%/13.79%；24.57%,27.13%/16.35%)；③外源性增加ADM50nmol/L和200nmol/L后,可以明显促进RKO和HT-29细胞的迁移,通过Transwell小室的贴壁细胞对照实验,RKO细胞：30.333±4.353,22.600±2.558/13.067±2.374；HT-29细胞：31.533±3.662,20.2±5.308/13.000±2.478(p均<0.01)。给予ADM200nmol/L未见较ADM50nmol/L对细胞的促迁移能力增加；④相对于对照组,无论单纯干扰ADMR或CRLR,还是联合干扰ADMR和CRLR, Transwell细胞迁移对照实验结果均显示RKO细胞迁移显著抑制(10.8±2.5,9.9±1.8,5.8±2.0/17.1±2.9,p均<0.01),尤其以联合干扰组的作用最为显著。在对转染了空载的细胞重新添加外源性ADM50nmol/L后,重见RKO细胞的迁移增加(从17.1±±2.9至37.3±±4.9),但是在ADMR、CRLR已下调后再外源性增加ADM,对细胞迁移增加的能力受限。同样在HT-29细胞迁移实验中也观察到了一致的结果。表明ADM对结肠癌细胞促迁移能力依赖于特异性受体；⑤Transwell细胞侵袭试验结果显示,相对于对照组,特异性干扰RKO细胞,无论单纯或联合干扰ADMR和CRLR,都可以显著抑制癌细胞的侵袭(12.6±1.4,11.8±1.8,6.9±2.0/17.1±1.2,p均<0.01),在转染了空载的细胞中再外源性添加ADM50nmol/L后,可以促进细胞的侵袭(从17.1±1.2至29.3±2.6),在ADMR. CRLR特异性下调后再外源性增加ADM,促进细胞侵袭的能力明显受限。在HT-29细胞侵袭实验中也观察到了一致的结果,说明ADM对结肠癌细胞促侵袭能力依赖于特异性受体。4. ADMR及CRLR分别调控多个与转移相关的下游互作基因筛选到ADMR的下游互作基因上调8个；CRLR的下游互作基因上调4个、下调1个。这些基因主要参与细胞增殖、凋亡和侵袭等癌细胞恶性生物学行为。qPCR证实其中的APC、EGF、PIK3CA、PIK3CB和DVL1的mRNA水平明显升高,而NOS2的mRNA水平显著下降,与其在基因表达谱芯片中的结果相符。综上述得出研究结论如下：1.ADM与ADMR、CRLR在人结直肠癌组织表达增高,并与结直肠癌分化、分期及有无淋巴结转移等恶性行为的临床病理特征有关。结直肠癌细胞株RKO和HT-29具有特征性代表。2.成功地将特异性构建的慢病毒ADMR shRNA和CRLR shRNA表达载体转导至结直肠癌细胞RKO和HT-29,能有效干扰ADMR及CRLR表达,并抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭等恶性行为。并证实ADM是通过特异性受体使癌细胞产生恶性生物学行为。3.发现了ADMR及CRLR相关的系列下游互作基因,并证实这些基因主要与肿瘤细胞生长、迁移和侵袭等生物学功能有关。