目的：观察褪黑素对Leydig细胞睾酮合成的抑制作用，初步探讨褪黑素影响睾酮分泌的作用机制。方法：（1）采用Leydig细胞原代培养模型，通过I型胶原酶消化法分离C57BL/6J小鼠睾丸间质细胞，以400（30μm）目不锈钢网对小鼠睾丸间质细胞进行过滤、纯化，对细胞进行台盼蓝染色，用3β-羟基固醇脱氢酶（3β-HSD）特异性染色法鉴定细胞，观察细胞形态学改变。（2）在培养的Leydig细胞中加入不同浓度(0，10-6，10-8，10-10和10-12mol/L)的褪黑素或/和褪黑素受体拮抗剂Luzindole（1μmol/L），作用30min后再加褪黑素，CCK-8法检测细胞活性和增殖，流式细胞仪检测细胞周期、线粒体膜电位和细胞活性氧（reactive oxidative species，ROS）水平，ELISA法检测睾酮水平。（3）将Leydig细胞分为对照组、褪黑素处理组与褪黑素/Luzindole联合作用组，免疫荧光法测定褪黑激素受体和睾酮合成相关基因Mel1a，GATA-4，StAR和3β-HSD的蛋白分布和表达。结果：（1）体外培养的细胞形态呈梭形、增殖速度快、贴壁生长状态良好。台盼蓝染色法显示，原代培养的Leydig细胞存活率在90%以上。3β-HSD特异性染色后，可见多数细胞胞质呈蓝黑色。成功建立了小鼠Leydig细胞的体外原代培养模型。（2）与对照组相比，加入褪黑素后，Leydig细胞增殖受到抑制，细胞培养上清液中睾酮含量降低，细胞线粒体膜电位下降，活性氧水平增高。褪黑素对Leydig细胞睾酮合成的抑制作用可被褪黑素受体拮抗剂Luzindole所阻断。（3）加入褪黑素后，睾酮合成关键调节因子Mel1a、 GATA-4、StAR和3β-HSD的分布与表达降低，该效应可被褪黑素受体拮抗剂Luzindole阻断。结论：1、建立了Leydig细胞原代培养模型，发现褪黑素可以抑制Leydig细胞的增殖，和睾酮的合成。2、褪黑素对睾酮合成的抑制作用可能是通过下调睾酮合成关键调节因子Mel1a、 GATA-4、StAR和3β-HSD等实现的。