研究背景:支气管哮喘是由多种细胞(如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等)和细胞组分参与的气道慢性炎症为特征的异质性疾病,以气道炎症和气道重塑(airway remodeling)为重要病理特征[1]。支气管哮喘如诊治不及时,随病程的延长可产生气道不可逆性缩窄和气道重塑。气道重塑的原因包括气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells,ASMCs)增生肥大、粘液腺增生、基底膜增厚、粘膜化生和新生血管的增加等,其中ASMCs增殖在气道重塑中占有十分重要的地位,并与气道高反应性密切相关。并通过上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)参与了气道的重塑。据报道,现如今发现很多种细胞因子及转录因子与EMT相关,如转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达的减少或缺失、转录因子(Snail+Slug)等。其中TGF-β1是诱导EMT的分散因子,TGF-β1已被证实在体内、外培养的大多数上皮细胞中,可诱导EMT的发生。随着社会的进步及化工业产业不断的发展,环境污染的日益加重,哮喘的发病率逐年增加,并得到了医疗界高度的关注,目前,治疗哮喘的方法主要以抗炎、平喘为主要手段,激素的利用率逐渐升高,鉴于激素对人体的副作用非常大,一部分学者把研究重心转移至中国传统药物的抗炎作用研究上,大力发展我国传统中药,本研究选用隐丹参酮(Cryptotanshinone,CTS)是活血化瘀类中药丹参的有效成分之一,具有清除氧自由基、改善微循环、抗炎、抗感染、抗肿瘤、提高机体免疫力等多种生物活性[2]。研究目的:为明确TGF-β1-TWEAK信号交叉对话来调控哮喘气道重塑炎症及EMT进程的相关分子机制。1、建立小鼠哮喘气道重塑模型,观察及检测哮喘小鼠气道炎症、气道重塑及气道反应性指标,探讨哮喘小鼠EMT进程的相关分子机制。2、检测TGF-β1-TWEAK交叉对话对哮喘小鼠气道炎症、气道重塑及EMT的影响,为治疗哮喘气道重塑提供有效的分子靶点,并初步阐明其可能的分子机制。3、检测经CTS给药治疗后,哮喘小鼠气道炎症及气道重塑的影响,为更好的预防与治疗哮喘气道重塑提供可靠地理论依据。材料与方法:1.小鼠建立小鼠哮喘气道重塑模型。观察指标:(1)小鼠进行雾化激发时的状态及行为观察;(2)利用动物肺功能仪测定肺阻力(Lung resistance,RL)的变化;(3)统计肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)细胞总数与嗜酸性粒细胞数;(4)将肺组织切片进行苏木精-伊红(haematoxylinandeosin,HE)染色、过碘酸雪夫(periodic acid-schiff,PAS)染色及Masson染色法观察小鼠肺组织形态学改变;(5)实时荧光定量酶链聚合反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测哮喘小鼠 EMT 相关标志基因 mRNA的表达水平;(6)免疫蛋白印记法(western blot,WB)检测E-Cadherin及Snail+Slug蛋白表达水平。2.WB检测人气道上皮16HBE细胞和鼠气道平滑肌RASMCs细胞中,E-Cadherin、Snail+Slug、TGF-β1、TWEAK、Fn14、TAK-1、NF-κB、α-SM)A及Collagen I蛋白表达水平;3.在成功建立的小鼠哮喘气道重塑模型的基础上,分别给药地塞米松(Dexamethasone,DXMS)治疗(OVA+DXMS 组)及 CTS 治疗(OVA+CTS组),观察指标:体外实验:(1)经不同浓度CTS(0、2.5、5、10、15、25)治疗后,MMT法检测大鼠平滑肌RASMCs细胞存活率,筛选出CTS的有效浓度;(2)WB 检测 RASMCs 细胞中,α-SMA、MMP-9、Collagen I、TIMP-1、TWEAK、Fn14、TGF-β1、TAK-1、NF-κB 蛋白表达水平;(3)流式细胞术检测RASMCs细胞周期。体内实验:(1)小鼠进行雾化激发时的状态及行为观察;(2)HE、PAS染色及Masson染色观察肺组织形态学改变;(3)免疫组织化学染色观察小鼠肺组织中Ki67的表达情况;(4)统计BALF中细胞总数与嗜酸性粒细胞数;(5)ELISA检测细胞因子IL-4、IL-5、IL-8、IL-13表达水平;(6)免疫组化染色观察,哮喘小鼠肺组织中α-SMA、TWEAK、TGF-β1蛋白的表达情况;(7)免疫荧光染色(IF)观察,哮喘小鼠支气管周围α-SMA蛋白的表达情况;(8)WB检测小鼠肺组织中α-SMA、MMP-9、Collagen I、TIMP-1、TWEAK、Fn14、TGF-β1、TAK-1、NF-κB 蛋白表达水平。结果1.第一部分实验结果(1)行为表现:OVA致敏的哮喘小鼠出现哮喘发作表现。(2)OVA组小鼠RL值随雾化吸入的乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)浓度的增加而升高(P<0.01)。(3)肺组织病理染色形态学改变:OVA组小鼠肺内可见大量炎性细胞浸润,气道壁增厚,杯状细胞增生,粘液腺分泌增加,胶原纤维增生。(4)OVA组小鼠BALF中细胞总数及嗜酸性粒细胞数明显增多(P<0.01)。(5)OVA组E-Cadherin基因表达降低,而Snail+Slug基因表达升高(P<0.01)。RT-qPCR、WB及IF各基因表达结果一致。2.第二部分实验结果(1)16HBE 细胞中 PDGF 组 E-cadherin 蛋白表达减少;Snail+Slug、TWEAK及TGF-β1蛋白表达均增加(P<0.01)。(2)经 si-TWEAK 及 SB-431542 处理后,PDGF 组 16HBE 细胞和 RASMCs细胞中TWEAK、Fn14、TGF-β1、TAK-1及NF-κB蛋白表达均明显增加(P<0.01);si-TWEAK 组 TWEAK、Fn14、TAK-1 及 NF-κB 蛋白的表达显著减少(P<0.01),TGF-β1蛋白表达无明显变化;SB431542组,TGF-β1、TAK-1及NF-κB蛋白表达显著减少(P<0.01),TWEAK、Fn14蛋白表达无明显变化。(3)16HBE细胞和RASMCs细胞经si-TAK-1处理后,与PDGF组比较,si-TAK-1组TWEAK、Fn14及TGF-β1蛋白表达无明显变化,而TAK-1及NF-κB蛋白表达显著减少(P<0.01)。(4)16HBE细胞经5Z-7处理后,与 PDGF组比较,5Z-7组α-SMA、Collagen I、Snail+Slug 蛋白表达均明显下调(P<0.01),E-Cadherin 蛋白表达上调(P<0.01)。(5)RASMCs细胞经5Z-7处理后,与PDGF组比较,5Z-7组α-SMA及Collagen I蛋白表达均下调。(6)RASMCs细胞经5Z-7处理后,与PDGF组比较,5Z-7组S期显著增加(P<0.05)。(7)经5Z-7处理后哮喘小鼠肺组织中,与OVA组比较,Ki67及Snail+Slug蛋白的表达均减少,E-Cadherin蛋白的表达增加。3.第三部分实验结果(1)RASMCs细胞经不同浓度CTS处理后,与PDGF组比较,从CTS 10μmol/L开始,RASMCs细胞增殖显著被抑制(P<0.01)。(2)RASMCs 细胞中,与 PDGF 组比较,CTS 组 α-SMA、MMP-9、CollagenI、TIMP-1、TWEAK、Fn14、TGF-β1、TAK-1、NF-κB 蛋白的水平显著下调(P<0.01)(3)RASMCs细胞经CTS 10 μmol/L处理后,与PDGF组比较CTS组S期显著增加(P<0.05)。(4)与OVA组比较,DXMS及CTS组小鼠肺组织中Ki67的表达较之明显减少。(5)经DXMS和CTS的治疗后,OVA组小鼠肺内气道壁增厚等病理变化均有所缓解。(6)DXMS和CTS组小鼠肺组织中α-SMA、TWEAK及TGF-β1蛋白的表达较OVA组明显减少。(7)DXMS和CTS组与OVA组比较,小鼠BALF中细胞总数及嗜酸性粒细胞数显著减少(P<0.01)。(8)DXMS 和 CTS 组较 OVA 组小鼠 BALF 中 IL-4、IL-5、IL-8、IL-13 的含量明显减少(P<0.01)。(9)CTS 组与 OVA 组比较,小鼠肺组织中 TWEAK、Fn14、TGF-β1、TAK-1、NF-κB、α-SMA、Collagen I、MMP-9 及 TIMP-1 蛋白表达显著减少(P<0.01)。结论1.EMT参与哮喘小鼠的气道重塑。2.抑制TGF-β1与TWEAK在TAK-1位点交叉对话,可明显降低哮喘小鼠气道炎症,抑制EMT的发生,减轻气道重塑。3.隐丹参酮可通过调控TGF-β1与TWEAK的交叉对话,从而抑制气道炎症及气道重塑,为哮喘未来的治疗提供新的靶向。