【研究背景】免疫系统在组织修复和再生过程中发挥了非常重要的作用。免疫稳态的调节失衡会导致多种疾病的发生。调节性T细胞（T regulatory cell,Treg）具有诱导和维持免疫耐受的能力,在预防过度炎症反应和维持自身耐受中发挥关键作用。Treg的功能异常引起的免疫应答失衡与多种疾病的发生发展密切相关,包括过敏性炎症疾病如过敏性哮喘,慢性炎症疾病如骨质疏松和肠炎,以及各种自身免疫疾病。随着对Treg的深入研究,人们尝试利用其免疫调节功能对各种炎症性疾病、自身免疫疾病、器官移植等疾病进行干预和治疗。目前已有多种途径可以在体内、体外诱导扩增Treg。在小鼠关节炎模型和结肠炎模型中,利用Treg治疗可有效改善疾病症状。对于自身免疫疾病而言,抗原特异性Treg针对特异性的抗原发挥抑制作用,并且对效应T细胞有更高的抑制效率。因此,抗原特异性Treg是治疗自身免疫疾病的更优选择。尽管抗原特异性Treg在预防自身免疫疾病的动物模型中显示出一定的效果,但其在临床中的积极疗效尚未被广泛报道。这可能是由于疾病状态下机体的免疫稳态失衡,T细胞处于过度活化状态。在这种炎症环境下,Treg可能会失去抑制活性,甚至转化为辅助性T细胞17（T helper cell 17,Th17）导致疾病复发。因此在利用Treg建立新的免疫耐受稳态之前,应首先减少过多的活化T细胞,改善已失衡的免疫状态。以往研究通过辐射破坏免疫系统或使用抗体减少活化的T细胞,但此类方法存在很大的脱靶风险。因此,亟需建立时序化、安全、有效诱导抗原特异性Treg并调控免疫稳态的新策略。生物材料的各种特性赋予其诸多优点,它在医学领域的应用也越来越多。可以通过各种修饰与改性,实现对细胞、组织和器官的精准化、时序化多功能调控。目前已有多种基于生物材料或以生物材料作为递送系统用于调控免疫系统的研究,提示可以借助生物材料实现对T细胞功能的调控,并在自身免疫疾病的治疗中有出良好的应用前景。【研究目的】为减少疾病个体中过量活化的T细胞并诱导Treg,我们合成了一种由单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）和凋亡细胞膜表面分子Fas ligand（Fas L）修饰的免疫调控型生物材料。它可通过释放MCP-1趋化活化的T细胞,并通过表面连接的Fas L诱导T细胞凋亡,以减少大量活化的T细胞;随后,巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬会刺激TGF-β的分泌,促进T细胞向Treg方向分化。进一步,我们将模块化概念引入材料的设计中。分别将实验性自身免疫性脑脊髓炎模型（Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）和1型糖尿病模型的自身抗原装载于材料中,在诱导Treg过程中长时释放,以期在EAE及1型糖尿病模型中实现抗原特异性Treg的诱导。【研究方法】1.可清除活化T细胞纳米颗粒（T cell-depleting nanoparticles,TDNs）的合成及其体外功能验证。首先在介孔二氧化硅纳米颗粒（Mesoporous silica nanoparticle,MSN）结构的基础上合成装载有MCP-1和Fas L的TDNs,并对其进行表征。其次,在体外分离小鼠脾脏T细胞,并用CD3/CD28抗体进行活化。随后通过Transwell共培养观察TDNs对T细胞的趋化功能。最后通过流式细胞术和Western blot观察TDNs体外诱导活化T细胞凋亡的情况。2.小鼠骨质疏松模型的建立及TDNs对骨质疏松的疗效观察。首先通过卵巢切除术建立小鼠骨质疏松模型。分离小鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）并鉴定其表面标志物。之后诱导BMMSCs成骨分化,检测成骨相关基因和蛋白的表达并通过茜素红染色检测钙化结节形成水平。通过流式细胞术检测小鼠外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）中CD3+T细胞比例及凋亡。利用Micro CT鉴定小鼠骨量的变化;分别通过流式细胞术和ELISA检测相关T细胞亚群比例及血清细胞因子水平。最后通过血清学指标和组织学染色对TDNs的生物安全性进行初步评价。3.模块化免疫调控微球（Immune-homeostatic microparticles,IHMs）的构建及其对EAE小鼠的治疗。首先合成具有模块化结构的IHMs,并将EAE疾病的自身抗原MOG35-55装载在微球中,得到IHMMOG微球。通过扫描电镜、动态光散射、能谱分析等方法对IHMMOG微球进行表征。建立小鼠EAE疾病模型,观察IHMMOG对EAE的治疗效果。通过流式细胞术检测PBMCs中CD3+T细胞比例及凋亡;H＆E染色及Luxol fast blue（LFB）染色评估脊髓组织学病理变化。最后用四聚体方法检测小鼠脊髓中抗原特异性Treg的产生。4.IHMGAD微球的合成及其对小鼠1型糖尿病的治疗。首先将模块化微球的自身抗原替换为1型糖尿病的自身抗原(GAD524-543),得到IHMGAD微球。对1型糖尿病NOD/Shi Lt J小鼠进行治疗,并用血糖仪监测小鼠血糖水平。其次,通过H＆E染色观察胰腺组织中胰岛炎症细胞浸润程度及胰岛数目变化;通过流式细胞术检测胰腺淋巴Th1和Treg的比例。最后分选脾脏CD4+和CD4+CD25-T细胞亚群,检测淋巴细胞对特异抗原刺激的应答。【研究结果】1.TDNs可在体外趋化并诱导活化T细胞发生凋亡。首先证实TDNs是以MSN为结构基础,MCP-1负载在MSN的介孔中,而Fas L被修饰在MSN的表面。其次,T细胞体外活化后,细胞形态发生明显变化,Fas蛋白和T细胞活化标志物CD25的表达均显著升高。流式检测结果显示TDNs处理后,活化T细胞的凋亡比例升高。另外凋亡关键蛋白Bax和Cleaved caspase-3表达增高,而Bcl-2表达降低。2.TDNs通过诱导Treg改善小鼠骨质疏松症状。首先成功建立雌激素缺乏诱导的小鼠骨质疏松模型,表现为小鼠股骨骨量明显下降。TDNs治疗后,外周血中CD3+T细胞的比例显著下降,伴随其凋亡比例的升高。进一步观察到脾脏Treg比例升高而Th17比例减少,同时小鼠股骨骨量显著恢复,其BMMSCs的成骨能力也得到了明显回升。3.IHMMOG微球通过诱导抗原特异性Treg治疗EAE。首先,成功建立小鼠EAE疾病模型。IHMMOG微球注射后,外周血T细胞发生显著凋亡。我们对EAE小鼠进行IHMMOG治疗后,观察到疾病评分得到了显著改善,脊髓组织的炎症细胞浸润程度也明显缓解,同时髓鞘流失显著减少。更重要的是脊髓组织中MOG35-55特异性Treg比例明显增多。最后我们证明IHMMOG是通过MCP-1和Fas L诱导T细胞凋亡,之后促进TGF-β分泌,最终产生抗原特异性Treg。4.IHMGAD微球通过诱导抗原特异性免疫耐受治疗1型糖尿病。首先我们观察到糖尿病NOD/Shi Lt J小鼠经IHMGAD治疗后,血糖水平得到了有效控制。对应的组织学结果显示胰岛的炎症细胞浸润程度也得到了显著改善。进一步发现,胰腺淋巴结中Treg的比例明显升高,而Th1的比例下降。此外,脾脏淋巴细胞也获得了针对GAD524-543的抗原特异性免疫耐受。最后我们证明IHMGAD是通过MCP-1和Fas L诱导T细胞凋亡,之后促进TGF-β分泌,最终产生抗原特异性免疫耐受。【研究结论】1.TDNs具有免疫调控功能,可在体外趋化并诱导活化的T细胞发生凋亡。2.TDNs通过诱导Treg调控免疫稳态并治疗骨质疏松。TDNs在体内通过MCP-1和Fas L趋化并诱导活化的T细胞发生凋亡,从而减少炎症条件下过度活化的T细胞。T细胞的凋亡信号被巨噬细胞识别后,促进Treg的产生以及骨质疏松小鼠骨量的恢复。3.模块化结构的IHMs通过装载不同的自身抗原,诱导抗原特异性Treg,治疗小鼠EAE和1型糖尿病。IHMMOG和IHMGAD在体内有序诱导T细胞凋亡,促进TGF-β分泌,同时IHMs装载的自身抗原长期低剂量释放,诱导抗原特异性Treg产生,达到治疗自身免疫疾病的目的。我们成功构建了模块化、具有免疫调控功能的生物材料,可应用于多种不同自身免疫疾病的治疗。