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柑橘溃疡病(Citrus canker)是一种毁灭性的检验检疫性病害,也是柑橘上最危险的病害之一,给柑橘产业造成巨大的经济损失,妨碍柑橘产业的健康可持续发展,引起了国内外研究学者的高度重视。但不同柑橘品种间对柑橘溃疡病的抗性有显著性的差异,其中会柑类几乎达到了免疫水平。研究表明,金柑在接种溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv. citri, Xac)后,体内的H2O2水平上升,显著高于其它感病品种,暗示H2O2可能与其对Xac的抗性有一定关系。目前,大部分研究认为在植物与病原互作体系中,H2O2的产生主要与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(Nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate oxidase, NADPH oxidase)有关。NADPH氧化酶主要位于质膜或吞噬体小膜上,是膜氧化还原系统的重要组成部分之一,它能催化胞质中的NADPH将电子转移给氧,生成活性氧(reactive oxygen species, ROS)。 ROS有超氧阴离子自由基、羟自由基、过氧羟基自由基、单线态氧、过氧化氢等多种存在形式,且这些自由基的氧化性都很强,并且半衰期很短,易转化成更为稳定的过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)。NADPH氧化酶(respiratory burst oxidase homologues, rboh)基因表达量直接反映叶片中NADPH氧化酶的表达量,且NADPH氧化酶被认为是诱导植物抗病过程中产生H2O2的主要酶系,而H2O2量的差异可能导致不同柑橘品种之间的抗性差异,具体表现为Xac菌量的高低。目前,已陆续从不同植物中克隆出新的rboh基因,但研究的重点主要在双子叶模式植物(如烟草、拟南芥等)上,关于柑橘的rboh基因报道较少,且对于不同品种对溃疡病抗性的研究多侧重在过氧化氢酶(Catalase, CA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(Peroxides, POD)等参数含量的变化上,但少有研究关于Xac侵染后柑橘rboh基因表达量的变化及其诱导H2O2与Xac之间的关系。本研究的主要目的就是通过研究不同柑橘品种受Xac侵染后叶片中Xac菌量和rboh基因表达量的变化,结合H2O2的含量变化以及接种后叶片症状,探讨NADPH氧化酶诱导H2O2量的差异是否是引起不同柑橘品种之间抗性差异的原因。因此,本研究以对Xac具有不同抗性的四个柑橘品种金柑(Fortumella margarita)、椪柑(Citrus reticulata Ponka)、甜橙(C. sinensis Osbeck)、葡萄柚(C. paradisi Duncan.)为材料,研究上述柑橘品种在离体条件下接种Xac后,叶片中H2O2含量、Xac菌量及rboh基因表达量的变化,旨在阐明不同品种柑橘之间抗性差异的可能原因及其与H2O2的关系。主要研究结果如下：1、不同浓度的H2O2对Xac具有不同的作用离体条件下分别通过平板法和液体培养基法测定不同浓度H2O2处理对Xac的抑菌效果,发现经500μM和5000μM H202处理时都有明显的抑菌圈,而经5μM和50μMH202处理时不仅没有抑菌,反而对Xac的生长有一定的促进作用。说明高浓度的H2O2对Xac有抑制作用,而低浓度的H2O2则略有促进作用。2、抗病品种受Xac侵染后诱导H2O2含量较高金柑、椪柑、甜橙、葡萄柚受Xac侵染后体内H2O2水平高低依次为：金柑>甜橙>葡萄柚>椪柑,其中抗性品种处理组金柑的H2O2含量(5.81～9.04μMg-1FW)始终高于对照组,且明显高于其它三个品种,而其它三个品种中则出现部分时段处理组H2O2水平低于对照组,其中甜橙(1.09～2.61μM g-1FW)和葡萄柚(1.00～2.65μg-1FW)中的H2O2的波动较大,椪柑的H2O2含量(0.89～1.41μg-1FW)波动不大。3、叶片离体接种后Xac菌量的变化与其体内积累的H2O2含量变化有一定关系通过测定金柑、椪柑、甜橙、葡萄柚受Xac侵染后体内Xac菌量的变化,发现金柑的Xac菌量变化最大,先是急速上升,在4dpi时达到最大为128,后又以较快的速度下降,14dpi时已降至16；相比其它品种,椪柑的Xac菌量(约4～16)变化不大,相对平稳,但在5dpi(约8)时Xac菌量迅速下降,仅为4dpi(约16)时的一半；而甜橙(约4～160)和葡萄柚(约5～160)的Xac菌量整体呈上升趋势。4、rboh基因可能与H2O2含量呈负相关关系通过测定金柑、椪柑、甜橙、葡萄柚受Xac侵染后体内rboh基因表达量的变化,发现金柑的rboh基因表达量(约0～4)的变化也是四个品种中最大的,整体呈下降趋势,尤其在4dpi时迅速的从2降到0.004,但在5dpi时又迅速回到3dpi时的水平(略低于2),8dpi时降至0.1,此后表达量相对稳定,约为0.3,整体表现出2个低峰,与金柑H2O2含量变化的2个高峰相反；椪柑rboh基因表达量(约0～2)变化相对较小,除4dpi时表达量降到最低(约0.006)外,其余时段均稳定在0.25～2,这与椪柑H2O2含量较低且变化不大情况吻合；甜橙(约0～2)rboh基因表达量的变化中出现2个低峰,而其H2O2含量变化中出现2次高峰；葡萄柚rboh基因表达量在4dpi时达到最低(约0.08),而其H2O2含量在此时达到最高(约2.5μM-1FW)。在10dpi时葡萄柚rboh基因表达量达到最高(约3.6),而其H202含量在此时达到最低(约1μMg-1FW)。这暗示rboh基因可能与H2O2含量呈负相关关系,但有部分情况不符合rboh基因与H2O2含量负相关的变化趋势,故而rboh基因与H2O2含量之间的关系还有待继续研究验证。